不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CVI988/Ripens株、强毒株GA、超强毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株.Jing-1及3个中国野毒株.结果表明MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96.7%～100%之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99.2%～100%之间.尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系.     

齐多夫定和单克隆抗体联合应用去除疫苗毒种中REV的污染

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)在禽弱毒疫苗中的污染被认为是REV感染的途径之一,去除疫苗毒种中REV的污染是生产合格疫苗的前提,此前我们研究证实了某IBDV疫苗毒种存在REV的污染,本研究试图通过核苷类逆转录酶抑制剂类药物齐多夫定(Azidothymidine,AZT)和针对REV的单克隆抗体(McAb)单独或联合应用来去除疫苗毒种中REV的污染。将污染REV的IBDV疫苗毒种接种DF-1细胞后,分别经5μg/mL的AZT,5%的McAb或两者联合应用干预后,毒种中污染的REV复制受到了明显的干扰,特别是经过AZT与McAb联合应用两次干预后,检测REV为完全阴性,毒种经检验合格。本研究通过AZT与McAb联合应用成功净化了IBDV疫苗毒种中REV的污染,为解决类似问题提供了新的思路。     

传染性法氏囊病病毒野毒株的致病性及其vp2基因比较

对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析.结果表明,4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异.其中有一个是真正的超强毒,即GX8/99,其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力,但也比经典的标准毒的致死性高得多.在vp2基因高变区,这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高,在DNA水平为96.8%～99.5%,在氨基酸(aa)水平为96.6%～100%.而与疫苗毒D78有很大差异,分别只有91.7%～93.6%和91.8%～93.2%.说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系.特别是SD-1/97、SD-3/98、JS-30/99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98.4%和98.6%以上,SD-3/99、JS-30/99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100%.然而,致病性特别高的GX8/99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96.8%～97.2%和96.6%～97.9%.相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46,GX8/99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异.     

抗IBDV独特型抗体杂交瘤细胞株的建立及其产物生物学特性测定

用纯化的抗IBDV IgG免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇（PEG）作用下融合,ELISA法检测筛选,经有限稀释法克隆3次,获得2株（5F₄株,2B₆株）分泌抗IBDV独特型抗体的杂交瘤细胞株,其能诱生Balb/c小鼠产生ELISA抗体效价分别为1∶12 800和1∶25 600的含抗IBDV独特型抗体的腹水。用此独特型抗体与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂乳化制备成抗IBDV独特型抗体疫苗,免疫接种SPF鸡和普通京白公鸡,然后用IBDV强毒株(SD株)2000 ELD50攻毒,SPF鸡免疫组50只,有5只发病、2只死亡;对照组10只全部发病,8只死亡。普通京白鸡免疫组30只,有7只发病, 1只死亡;对照组10只全部发病,6只死亡。经X²检验,SPF鸡X²＝34.15,普通鸡X²＝16.68,查X²值表得X²_(1)0.01＝6.63, SPF鸡X²和普通鸡X2均大于X²_{(1) 0.01}（P＜0.01）,由此表明抗IBDV独特型抗体疫苗具有很好的免疫原性,对易感日龄的SPF鸡和普通鸡均具有极其明显的保护作用。从而证实了抗IBDV独特型抗体疫苗有潜在的研究和应用价值。     

带有REV-LTR片段的马立克氏病毒重组野毒株与超强毒株致病性和传播性比较

摘要：【目的】GX0101是一株插入了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)-LTR片段的马立克氏病毒（MDV）重组野毒株,本文将其致病性、致肿瘤性和横向传播能力与超强毒参考株（vvMd5）进行比较。【方法】利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA进行检测。【结果】在经抗MDV疫苗免疫的SPF鸡攻毒试验中表明,GX0101株的致死率28.6%和致肿瘤率7.1%均低于超强毒参考株Md5的致死率63.1%和致肿瘤率19.0%。但是,利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA检测表明,     

接种不同毒力的马立克氏病病毒后鸡病毒血症的动态比较

1日龄非免疫鸡分别接种马立克氏病病毒（MDV）I型强毒GA株、I型MDV疫苗毒CVI988株和III型火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗株后第4日起,定期采血并用抗MDV囊膜糖蛋白B（gB）单克隆抗体介导的间接免疫荧光试验检测MDV在外周血液单核细胞（PBMC     

敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CVI988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较

【目的】比较敲除meq基因的马立克氏病毒(MDV)与标准疫苗株CVI988/Rispens对MDV超强毒GX0101攻毒的免疫保护作用。【方法】本实验将1日龄SPF鸡120只随机分成4组,每组30只,分别饲养在正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,第1组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种SC9-1;第2组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种CVI988/Rispens;第3、4组为不免疫攻毒对照组。免疫接种后5 d后,第1、2、3组分别以2000PFU/只的剂量腹腔接种MDV GX0101。饲养至90日龄,记录死亡情况,对死亡鸡只剖检,并取疑似马立克特有病变脏器做病理切片。期间,检测不同免疫状态下病毒GX0101的增殖动态以及禽流感、新城疫灭活苗在鸡体诱导产生抗体的水平。对含有MDV母源抗体的海蓝褐鸡的试验方案与SPF鸡一致。【结果】SC9-1株免疫对感染MDV GX0101攻击SPF鸡、海兰褐鸡均提供100%的免疫保护作用;CVI988/Rispens对SPF鸡、海兰褐鸡分别提供86.7%、93%的免疫保护作用。未免疫SPF鸡攻毒组死亡率为53.3%,肿瘤率为16.7%;未免疫海兰褐鸡攻毒组死亡率为36.7%,肿瘤率为6.67%;相比,空白对照组鸡只没有任何病变及死亡。荧光定量结果显示,淋巴细胞和羽毛囊DNA中,SC9-1免疫组鸡体内GX0101的病毒拷贝数显著低于CVI988/Rispens免疫组。血凝抑制试验结果显示,SC9-1免疫攻毒组鸡的产生的AIV、NDV抗体水平高于CVI988/Rispens免疫攻毒组。【结论】SC9-1株免疫无论在SPF鸡还是含有MDV母源抗体的海兰褐鸡均能提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。     

Ⅰ型马立克病毒UL24蛋白的原核表达及其亚细胞定位的研究

为研究Ⅰ型马立克病毒(MDV)UL24蛋白的亚细胞定位,以MDV GX0101为模板,PCR扩增UL24基因全长,分别克隆到原核表达载体pGEX-6P-1、pET-32a(+)和真核表达载体pEGFP-C1中。将原核表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中表达,并进行纯化和鉴定。用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,制备并鉴定抗UL24蛋白的多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验(IFA)检测感染GX0101的鸡胚成纤维细胞(CEF)中的UL24蛋白。同时,将真核表达重组质粒pEGFP-C1-UL24转染CEF细胞,通过激光共聚焦显微镜观察UL24蛋白在CEF中的亚细胞定位。结果显示Ⅰ型MDV的UL24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后获得抗UL24蛋白的多克隆抗体。该抗体可特异性识别MDV UL24蛋白,且MDV UL24蛋白在CEF的细胞质和细胞核中定位,以上研究结果为进一步研究MDV UL24基因的功能奠定基础。     

马立克氏病病毒pp38／pp24聚合体结构及其对pp38基因上游双向启动子活性的影响

前期以氯霉素乙酰转移酶（CAT）活性为指标的研究证明了,马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）的pp38和pp24的同时表达可显著增强基因组中pp38基因与1．8kb mRNA转录子之间双向启动子的转录活性．本研究又以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达水平作为pp38基因上游双向启动转录活性的标志,更直观地证明了只有当同一细胞内同时表达pp38和pp24时,该启动子活性才有完整的启动活性．为了证明这两个蛋白能否相结合,分别以单独表达pp38或pp24的重组质粒pcDNA-pp38或pcDNA-pp24及能同时表达这两个基因的重组质粒pBud-pp38-pp24质粒转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,用pp38特异的单克隆抗体H19对转染细胞的裂解标记物进行免疫沉淀实验．结果表明,H19可沉淀pp38,但pp24只是在pp38同时存在时才被H19沉淀,而在pcDNA-pp24单独转染的处理样品中不能显示pp24的条带．这证明了,pp24是通过与pp38的结合而被共沉淀下来的,显示pp24和pp38在天然状态下可以形成异二聚体或多聚体．上述两个独立的实验结果表明,pp38和pp24是以聚合体的形式结合于该双向启动子发挥作用的．     

I型马立克氏病毒38kD磷蛋白与Ⅱ和Ⅲ型病毒间的交叉免疫反应

由致病性Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)特异性的单克隆抗体H_(19)制备亲和层析柱,从感染重组杆状病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞系Sf9细胞中提纯MDV的pp38基因表达产物,以此免疫小鼠制备抗血清,测定其与不同型MDV毒株感染的鸡胚成纤维细胞免疫反应性,同时也用不同型MDV毒株(HVT,Z4)制备的抗血清和自然感染发病鸡血清分别与感染重组病毒的Sf9细胞进行免疫交叉反应.试验结果表明,完整的Ⅰ型MDV来源的pp38基因产物与所试Ⅱ型Z4株和Ⅲ型HVT Fc126毒株在抗原性上有显著交叉反应.这一结果表明,在Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株中可能存在着pp38的类似物.