组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）cDNA序列的测定

已经从ｍｅｌａｎｏｍａ细胞系中成功地获得了人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ,在此基础上用双脱氧终止法测定了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ编码区全序列及３′非编码区部分序列,并发现与Ｐｅｎｎｉｃａ等发表的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ序列相比,有两处差异,其一是第１７２５位核苷酸残基为Ｃ而非Ａ,并使此处序列与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比新产生一个ＳｔｙＩ切点,但由于差异发生在密码子第三位,没有引起编码的氨基酸变化;其二是第１７７７位核苷酸残基（终止密码子后第４位核苷酸残基）为Ｔ而非Ｇ,使与终止密码子相隔３个核苷酸残基处产生了一个新的ＴＧＡ,与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比此处的ＢｓｔＮＩ切点也消失了。     

tPA K_2编码区mRNA二级结构对其在大肠杆菌中表达的影响研究

序列分析中发现ｔＰＡＫ２编码区结构基因中存在一段反转重复序列,富含Ｇ、Ｃ。利用计算机预测ｔＰＡｍＲＮＡ二级结构证明ｔＰＡｍＲＮＡ在此处可以形成△Ｇｍ＝－２５．５ＫＣａｌ／ｍｏｌ的发夹结构。本研究利用定点突变技术消除了这段反转重复序列,在大肠杆菌中进行了消除前后ｔＰＡ转录和翻译水平的比较。结果表明消除之后,细菌总ＲＮＡ中ｔＰＡ特异ｍＲＮＡ含量减少,细菌表达产物中ｔＰＡ蛋白占破菌沉淀物的百分比却基本不变。提示大肠杆菌中基因编码区ｍＲＮＡ二级结构一般不构成转录的终止,但有利于ｍＲＮＡ的稳定性,对翻译表达无影响。     

宋内氏福氏2a双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株的研究Ⅱ:生物学特性的研究

进一步对FS54—2、—3、—4、—5、—6、—7及—7b等双价减毒株的侵袭力、毒力、免疫原性与免疫保护性及遗传稳定性等进行了研究,证明双价减毒株仍保持了入侵肠上皮细胞的能力;小动物实验安全低毒;有很好的免疫原性,对小鼠有很好的双重免疫保护性。     

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳纤维蛋白自显影法检测不同分子…

ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）纤维蛋白显影方法是经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ将不同分子量的纤溶酶原激活剂（ＰＡ）分开,然后再转溶纤维蛋白板使之产生溶带而检测ＰＡ物质活性及分大小的方法,此法与Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法此具有检测更简便、灵敏、快速的特点,且是活性检测,但其分子量分析精度不如Ｗｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。本研究用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纤维蛋白自显影方法对本室表达的生组组织型－ＰＡ及突体Ｎ１１７Ｑ     

异源表达番茄LeMPK3基因提高烟草的抗低温胁迫能力

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号系统在植物应对环境胁迫中发挥重要作用。为了探讨LeMPK3基因在低温胁迫中的功能,我们从番茄中分离了LeMPK3基因并将其转化到烟草中,获得了异源表达LeMPK3基因的转基因烟草。RT-PCR分析结果表明,番茄幼苗在低温和高温胁迫及外源物质——过氧化氢(H2O2)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)处理下LeMPK3基因的表达量提高。在烟草中异源表达LeMPK3基因可以提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,增加脯氨酸和可溶性糖的含量,增强逆境相关基因的表达。说明异源表达番茄LeMPK3基因提高烟草对低温的抗性。     

植物种多样性对生态系统功能的影响

采用8种1年生植物,利用室外盆栽方法构建的植物群落对物种多样性与群落生产力、杂草入侵性之间的关系及其潜在的作用机理进行了研究.结果表明,各物种单播时其生产力和抗杂草入侵能力都有较大差异.物种多样性与群落生产力之间不存在线性关系,而呈现单峰格局关系,即在一定范围内(本研究为4种),物种多样性对生产力增加有促进作用,超过该范围,物种多样性增加,群落生产力不再增加.但群落生产力和物种多样性均与杂草入侵量之间呈显著负相关关系.相对产量总和(RYT)分析表明,资源互补效应是本研究中所观察到的多样性-生产力、多样性-入侵性及生产力-入侵性关系的主要作用机理.     

鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片段的人源化分子设计

产生免疫原性的残基都是位于蛋白表面的暴露残基,为了消除鼠抗体对人的免疫原性,利用表面再塑方法对本室克隆的鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片断进行了人源化分子设计。首先确定了鼠及人Fv表面残基,在此基础上分析了鼠与人Fv间表面残基的差异,将有差异的鼠表面残基换成人的。提出了残基最高频率人源化及最相似链人源化两种人源化方案。人源化后鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv的结构经Profile-3D验证是合理的,置换的表面残基溶液可及性未变,且未影响CDRs的结构,应不会影响与纤维蛋白的亲和力,为鼠抗体人源化实验研究奠定了基础。     

t-PA K1区的同源模建及Kringle区与赖氨酸相互作用的研究

利用同源模建方法预测了t-PAK1区的三维结构。通过结构叠合确定了t-PAK1、K2区,纤溶酶原K1、K4区及UKK区的赖氨酸结合口袋。静电势计算及疏水性分析表明,在t-PAK2区以及纤溶酶原K1、K4区与纤维蛋白裸露的赖氨酸之间存在明显的静电势互补和疏水面契合。确定了影响Kringle区结合口袋与赖氨酸亲和的重要氨基酸,分析了t-PAK1区、UKK区不能结合赖氨酸的原因,由此设计了具有赖氨酸亲和力的新型t-PAK1区及UKK区突变体。利用模拟残基突变技术预测了突变体的结构变化,分析了突变后t-PAK1区及UKK区与赖氨酸亲和力的变化,初步在理论上肯定了设计方案的合理性。     

组织型纤溶酶原激活剂工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

构建了突变体t-PA,使其在CHO-dhfr细胞中表达。获得t-PA工程细胞系。对该细胞系进行了遗传特性分析,在培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定处理并将细胞滴片、染色,进行染色体分析,结果表明,该工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒、四倍体、裂隙、断片、微小体,畸变率为15％,属于正常范围。同时进行成瘤性检测,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以人宫颈癌细胞(Hela细胞)为阳性对照,CHO-dhfr细胞为阴性对照,试验表明,t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGl在CHO细胞中的高效表达

为了得到ｔＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧＩ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线性化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯｄｈｆｒ－）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１０６细胞·２４ｈ的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间约为３６ｈ,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株