新型核心蛋白聚糖靶向性重组腺相关病毒的制备与鉴定

核心蛋白聚糖(decorin, DCN)是广泛存在于细胞基质中的一种富含亮氨酸的蛋白多糖, 属于蛋白聚糖家族中的小分子类. DCN可作为多种细胞因子的配体, 发挥多种生物学功能. DCN在一些肿瘤组织中高水平表达,调控恶性肿瘤的生长和迁移. 腺相关病毒(AAV)是肿瘤基因治疗中常用的基因工程载体, 利用重组技术可以实现对病毒衣壳蛋白的改造, 使其感染具有靶向性. 而针对DCN高表达细胞的转导可能成为肿瘤基因治疗应用中定向导入治疗基因的有效策略. 本研究在对多种DCN结合蛋白序列保守区的分析基础上, 筛选出具有较高活性的DCN结合功能域(DB1), 并将其融合至AAV衣壳蛋白VP2编码序列的N端; 继而利用AAV的嵌合包装技术, 成功制备了衣壳展示DB1表位的重组AAV. 在过表达DCN细胞的感染实验中, 该病毒表现出针对DCN较强的靶向性. 本研究所制备的DCN靶向性腺相关病毒不仅为肿瘤治疗的应用提供了一种新型载体, 同时可作为一类特殊的基因导入工具为研究DCN在肿瘤发生发展中的作用提供帮助.     

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究

为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2／hTNFR：Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT—PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFa细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示：所构建的重组病毒rAAV2／hTNFR：Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR：Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。     

表达血管抑制因子的腺相关病毒载体的构建及其体内外活性

血管抑制因子(Vasostatin,VAS),为集钙蛋白N-末端180个氨基酸大小的蛋白,是一种内源性血管生成抑制因子,对多种肿瘤的生长具有很强的抑制作用.近期有研究显示,VAS可以促进神经内分泌肿瘤的恶化,提醒研究人员在开发该抗肿瘤药物时必须非常谨慎.将VAS cDNA插入腺相关病毒-2表达质粒pAAV-2,采用无辅助病毒参与的三质粒共转染法制备rAAV-VAS病毒.体外分别转染小鼠胰内皮细胞MS1和结肠癌细胞HCT-116,MTT法测定对细胞生长的影响,Western blotting方法检测VAS的表述.采用小鼠皮下移植瘤模型,验证VAS的表达对肿瘤生长、新生血管密度、以及细胞增殖的作用.结果证明构建的rAAV-VAS病毒载体,能抑制小鼠胰内皮细胞的生长,转染HCT-116后能有效表达VAS蛋白,但HCT-116的体外生长不受影响.瘤体注射rAAV-VAS后,HCT-116移植瘤在小鼠体内的生长速度明显减缓,肿瘤新生血管密度明显降低.结果显示,rAAV-VAS可以抑制HCT-116移植瘤的新生血管形成,但对其细胞增殖无明显作用.     

Comparative study of the transfection efficiency of commonly used viral vectors in rhesus monkey (Macaca mulatta) brains

Viral vector transfection systems are among the simplest of biological agents with the ability to transfer genes into the central nervous system.In brain research,a series of powerful and novel gene editing technologies are based on these systems.Although many viral vectors are used in rodents,their full application has been limited in non-human primates.To identify viral vectors that can stably and effectively express exogenous genes within nonhuman primates,eleven commonly used recombinant adeno-associated viral and lentiviral vectors,each carrying a gene to express green or red fluorescence,were injected into the parietal cortex of four rhesus monkeys.The expression of fluorescent cells was used to quantify transfection efficiency.Histological results revealed that recombinant adeno-associated viral vectors,especially the serotype 2/9 coupled with the cytomegalovirus,human synapsin Ⅰ,or Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ promoters,and lentiviral vector coupled with the human ubiquitin C promoter,induced higher expression of fluorescent cells,representing high transfection efficiency.This is the first comparison of transfection efficiencies of different viral vectors carrying different promoters and serotypes in non-human primates (NHPs).These results can be used as an aid to select optimal vectors to transfer exogenous genes into the central nervous system of non-human primates.     

携带反义凝血酶受体和p21双基因共表达腺病毒伴随病毒载体的构建与包装

为探讨双基因共表达对再狭窄的防治作用,分别构建了含反义凝血酶受体(ATR)或/和p21单、双基因及报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒伴随病毒(AAV)载体.上述载体经脂质体介导转染BHK-21细胞, G418筛选获得整合有外源基因的细胞株.克隆形成过程中显示单、双基因转染后细胞增殖受到了不同程度的抑制,克隆形成速度减慢,细胞形态改变,且双基因的作用明显大于单基因.以绿色荧光出现说明报告基因得到表达后,又以DNA印迹证实ATR和p21单、双基因已整合于细胞基因组中,并维持了凝血酶受体(TR)基因的反义位置.半定量RT-PCR证实TR基因表达降低,p21基因表达升高,ATR和p21(AP)双基因得到了共表达.以具有可提供复制和包装功能的重组单纯疱疹病毒rHSV-rc/ΔU12分别感染载有不同基因的BHK细胞株,包装产生重组AAV(rAAV)病毒, 并经点杂交法测定其滴度(每毫升病毒液中所含病毒颗粒数).rAAV/AP中ATR与p21的病毒颗粒数分别为1.02×10¹³/ml和1.08×10¹³/ml, 单基因rAAV/ATR的滴度为6.54×10¹²/ml,rAAV/P21为1.06×10¹³/ml,为进一步的体内外实验奠定了物质基础.     

HIV-1B亚型gp120基因密码子优化前后免疫原性的比较

对HIV-1B亚型gp120基因按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Westem blot方法比较其体外表达量.将优化前的野生型gp120基因和改造后的modgp120基因插入重组腺伴随病毒载体,构建了重组病毒rAAV-wtgp120和rAAV-modgp120,比较两者免疫Balb/C小鼠后的抗体和CTL应答.Western blot检测结果显示:优化后基因的体外表达量明显高于野生型基因,rAAV-modgp120与rAAV-wtgp120相比可更好地诱导Balb/C小鼠的CTL应答,但检测不到明显的抗体反应.由此得出结论,优化后gp120基因的体外表达量明显高于野生型基因,并且可以诱导更强的特异性CTL应答,但检测不到gp120抗体.     

含HIV-1 gag、gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒的构建及其免疫原性的研究

将HIV－1中国株42（B亚型）gag基因及gag与gp120 V3区的嵌合基因gag V3插入腺病毒伴随病毒（AAV）表达载体（pSNAV）质粒中,构建重组质粒pSNAV-gag及pSNAV-gagV3;采用脂质体转染的方法分别将重组质粒转入BHK细胞,G418筛选得到转入重组质粒并能表达外源基因的细胞系,命名为BHK－gag及BHK－gagV3。用具有重组腺病毒伴随病毒（rAAV）包装功能的一种重组单纯疱疹病毒（rHSV）分析感染这两株细胞系,纯化后得到rAAV,电镜观察可见到大量实心病毒颗粒,核酸杂交检测重组病毒滴度达到10^12病毒颗粒／ml,重组病毒感染293细胞,ELISA检测有gag及gagV3基因的表达。用重组病毒免疫Balb/C小鼠,检测抗体及细胞免疫水平,证明重组病毒可以在小鼠体内诱导产生细胞及体液免疫。     

重组腺相关病毒规模化生物包装技术

重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)的诸多优点使其成为具有巨大潜力的人类基因治疗载体。人类基因治疗临床前和临床研究以及基因治疗产品的市场化要求rAAV载体生产的规模化。自1989年野生型的腺相关病毒序列被Samulski报道以来,rAAV的生产工艺已经从传统的质粒共转染发展到应用包装细胞系和生产细胞系,包装细胞也从"人体细胞"衍化到"昆虫细胞"。目前rAAV的生产规模和病毒载体质量都完全可以符合临床应用要求,有效地促进rAAV在基因治疗临床上的广泛运用。以下将着重介绍rAAV规模化生物包装技术的发展趋势,尤其各种规模化生产系统的要点。     

Gene replacement therapy restores RCBTB1 expression and cilium length in patient-derived retinal pigment epithelium

Biallelic mutations in the RCBTB1 gene cause retinal dystrophy. Here, we characterized the effects of RCBTB1 gene deficiency in retinal pigment epithelial (RPE) cells derived from a patient with RCBTB1-associated retinopathy and restored RCBTB1 expression in these cells using adeno-associated viral (AAV) vectors. Induced pluripotent stem cells derived from a patient with compound heterozygous RCBTB1 mutations (c.170delG and c.707delA) and healthy control subjects were differentiated into RPE cells. RPE cells were treated with AAV vectors carrying a RCBTB1 transgene. Patient-derived RPE cells showed reduced expression of RCBTB1. Expression of NFE2L2 showed a non-significant reduction in patient RPE cells compared with controls, while expression of its target genes (RXRA, IDH1 and SLC25A25) was significantly reduced. Trans-epithelial electrical resistance, surface microvillus densities and primary cilium lengths were reduced in patient-derived RPE cells, compared with controls. Treatment of patient RPE with AAV vectors significantly increased RCBTB1, NFE2L2 and RXRA expression and cilium lengths. Our study provides the first report examining the phenotype of RPE cells derived from a patient with RCBTB1-associated retinopathy. Furthermore, treatment of patient-derived RPE with AAV-RCBTB1 vectors corrected deficits in gene expression and RPE ultrastructure, supporting the use of gene replacement therapy for treating this inherited retinal disease.