“电子”cDNA文库筛选指导基因的全长cDNA克隆

“电子”ｃＤＮＡ库筛选主要是指通过采用生物信息学的方法延伸表达序列标签（ＥＳＴ）序列,以获得基因的部分及至全长ｃＤＮＡ序列,避免或部分避免构建与筛选ｃＤＮＡ库等烦琐的实验室工作。该方法具体体现了ＥＳＴ数据库的迅速扩张已导致识别与克隆新基因的策略发生革命性的变化。ＥＳＴ序列ＺＡ７３为本实验室克隆到的可能参与辐射致气管上皮细胞恶性转化过程的基因片段,本研究采用“电子”ｃＤＮＡ库筛选的方法对其可能     

盐藻基因组DNA文库的构建(英文)

以ＬａｍｂｄａＦＩＸ○ＲⅡ为载体,构建了盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ）的基因组文库。该文库包含了１．１×１０６个重组子,插入片段平均大小为１８ｋｂ左右,含插入片段的频率为１００％。该文库的容量约为盐藻单倍体基因组的２００倍。     

用RACE结合cDNA文库筛选的方法获取新的锌指蛋白基因

大多数有重要功能的蛋白质都含相应的由保守氨基酸顺序组成的功能结构域。本文首先根据蛋白质功能结构域保守氨基酸序列设计简并引物,用PCR方法扩增出基因EST序列,再利用改进的快速扩增cDNA末端（RACE）方法从cDNA文库中扩增出基因非同源部位,然后以非同源序列为探针,筛选cDNA文库。利用此方法成功地从人骨髓cDNA文库中克隆到几个编码锌指蛋白并代表原有EST的新的全长cDNA。这一策略也应适用于筛选编码具有其他序列保守性功能结构域蛋白的基因。 Abstract:Most of the important functionally proteins contain the corresponding function domains that consist of conserved amino acid sequences.The study provided a method to identify novel genes that encode proteins containing important functionally domains with conserved sequences.First,primers were designed according to the sequence of the cDNA library vector and the ESTs that have been obtained by reverse PCR and degenerate primers encoding Zinc finger domain.The cDNA library DNA was used as template for PCR amplification.The amplified fragment that contains nonhomologous sequences of the cDNA was inserted into pGEM-T easy vector.The fragment was recovered and used as a probe for screening the cDNA library.Several cDNAs with full length that encode proteins with Zinc finger domain and represent the original ESTs have been successfully cloned from a human bone marrow cDNA library.This strategy can also be used in screening genes that encode proteins containing differential function domains with conserved sequences.     

香猪肌肉组织cDNA文库的构建及其EST测序成功率的分析

以香猪背最长肌为实验材料,以Lambda ZAP II为载体,构建了肌肉组织的cDNA文库。结果表明,cDNA文库的滴度在3.4×107 pfu/ml以上,重组率在94%以上,插入片段大小平均在1.5kb以上。同时指出,如果从3′端测序,多于30 个碱基T的插入片段是造成ESTs测序成功率低的主要因素。 Abstract:Using Longissimus Dorsi muscle as material and Lambda ZAP II as Vector,Xiang Pig Longissimus Dorsi muscle cDNA library has been constructed in our study.The results showed that the tritation of the library was 3.4×107 pfu/ml,the recombinant percentage was 94%,and the fragment length of inserted average cDNA were 1.5kb.The study pointed out that the more than 30 T insertion is the major factor for low percetage if sequencing the 3′-end.     

在cDNA文库构建中探究癌症病人血浆外泌体miRNA的特异性扩增

血浆外泌体微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)与癌症的发生、诊断和治疗密切相关,但其分子机制尚不明晰。本研究探讨了癌症病人血浆外泌体miRNAs在cDNA文库构建中非特异性扩增的解决方案。在酶切法中,采用核酸外切酶T (exonuclease T, EXOT)和phi29 DNA聚合酶降解引物;在磁珠法中,利用DNA结合磁珠分离模板和引物。随后,采取琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测磁珠分离情况,运用RT-qPCR检测癌症病人血浆外泌体miRNA和不同连接物的含量变化。结果显示,非特异性扩增来源于miRNA的连接物USR5SR;核酸外切酶T (EXOT)和phi29 DNA聚合酶虽可降解USR5SR,但模板链也会发生降解;磁珠分离法中以9%PEG沉淀引物片段、15%PEG沉淀模板链效果最佳。综上所述,磁珠分离法能够高效解决cDNA文库构建中的非特异性扩增,从而实现293T细胞和癌症病人血浆外泌体miRNA cDNA文库的成功构建。     

水稻中与盐碱适应性相关的VB12不依赖型蛋氨酸合成酶基因的克隆和表达

水稻中与盐碱适应性相关的VB12不依赖型蛋氨酸合成酶广泛在于高等植物中，它可催化高半光氨酸甲基化而生成蛋氨酸，为生物体内的甲基化反应和多胺，乙烯的合成提供中间产物。以水稻品种日本晴为材料，在碱性条件下利用cDNA-RAPD法，在水稻中首次报道了VB12不依赖型蛋氨酸合成酶基因的克隆和表达，结果表明：VB12不依赖型蛋氨酸合成酶cDNA基因全长为2740bp，在水稻基因组中以单或低拷贝存在，编码765个氨基酸，与Mesembryanthemum cystallinum (784889)和Cathararanthus roseus(C83499)的同源性分别为92％和83％，水稻在受到碳酸钠胁迫12h和24h后，其转录较氯化钠明显增强，而到48h后下降，暗示它可能与水稻的盐碱适应性有关。     

人白细胞介素6cDNA克隆的分离与鉴定

我们从重组的人α干扰素处理的单层HeLa细胞常规提取Poly(A)~+RNA作为逆转录合成cDNA第一链之模板,用引物-适配接头法在噬菌质粒pTz19R中构建cDNA文库。以~(32)p-标记的480bpIL-6cDNA片段作探针进行菌落原位及狭缝印迹杂交,筛选出6个阳性克隆。其中两个克隆并用限制酶切分析及DNA序列测定做进一步鉴定。结果证明,一个克隆的cDNA片段长1.3kb,含有人白介素6全长编码区;另一个的cDNA插入片段为0.9kb,缺乏信号肽及成熟IL-6N端30个残基的编码序列。     

黑色素瘤细胞单域抗体文库的构建及鉴定

黑色素瘤作为一种多发于皮肤部位的恶性肿瘤,严重危害着动物和人们的健康。与传统抗体比较,单域抗体具有结构简单、分子量小、免疫原性弱等特点,使其在疾病的诊断及治疗方面具有广阔的应用空间。本研究以B16-F10细胞蛋白质为研究对象,通过反复冻融与超声破碎相结合的方式获得B16-F10蛋白质作为抗原,免疫成年雄性羊驼。采用噬菌体单域抗体展示技术,构建了质量优良的B16-F10细胞蛋白质单域抗体免疫文库,其库容为5.76 × 10¹⁰,VHH重组率为96%,文库丰度为3.00 × 10¹⁰个/mL。该结果为研究黑色素瘤的生物学特性提供了新思路,同时也为后续筛选B16-F10单域抗体奠定了基础。     

蝶兰胚珠的cDNA文库构建及其特异基因表达的研究

以蝶兰（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ＂Ｍｔ．Ｋａａｌａ”ｃｖＳＭ９１０８）为材料,分别提取大孢子母细胞时期胚珠和成熟胚珠的ＰｏｌｙＡＲＮＡ,反转录成ｃＤＮＡ,构建起两个ｃＤＮＡ文库。克隆筛选采用差异杂交法。从上述两个ｃＤＮＡ,对其在植物体不同器官和不同发育时期的胚珠内的表达进行了分析。结果表明该两个ｃＤＮＡ均为胚珠特异,并且分别在胚珠发育的特定时期表明。推测该两个ｃＤＮＡ的表达受胚珠内部的不同因子调控     

用λ－ZAPⅡ作载体构建豌豆卷须cDNA文库

用改进的异硫氰酸胍－苯酚－氯仿抽提法提取了豌豆卷须总ＲＮＡ并纯化了ｍＲＮＡ,合成双链ｃＤＮＡ后加上人工接头,Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂ柱层析去掉小片段,最后连入载体λ－ＺＡＰⅡ并用噬菌体包装蛋白进行体外包装,经稀释测定出含有重组子的文库大小为９．２×１０~５．原位杂交筛选出了肌动蛋白阳性克隆。