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31.
目的:介绍一种简便、有效的定点突变技术。方法:根据突变位点附近的DNA序列推导出氨基酸序列,再以此氨基酸序列进行逆翻译,这样在不改变氨基酸序列的前提下可以得到数目巨大的隐性突变体(silent mutants),这些突变体中包含大量的限制性内切酶位点,选择合适的酶切位点设计引物用PCR技术扩增两侧DNA片段,然后以相应酶切融合这两个片段即可完成定点突变。结果:用该方法成功地在人工合成的含有缺失的可溶性组织因子基因的472位插入C,T两个碱基,校正了阅读框架,获得了预期的目的基因。结论:该方法简便、有效, 避免了多轮PCR和合成长引物导致突变的可能性,这种改进的PCR 定点诱变技术我们称之为“设计限制酶辅助突变”(Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis, DREAM)。此技术简单方便, 诱变的成功率高, 适于实验室常规应用。 相似文献
32.
33.
抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates,ADC)是一类由单克隆抗体和小分子细胞毒性药物通过连接子偶联而成的新型生物治疗药物。与传统的细胞毒药物相比,ADC具有靶向性强、毒副作用小等优势,在临床上展现较好的治疗潜力。其中,抗体部分通过与肿瘤细胞表面的靶向抗原结合,精准地将小分子细胞毒性药物递送至肿瘤部位,从而实现肿瘤特异性杀伤效果,是影响ADC疗效的核心要素之一。对近年来ADC药物中抗体的组成及其作用靶点的研究进展进行了综述。 相似文献
34.
不同功能位点介导α干扰素的免疫调节和中枢镇痛作用 总被引:6,自引:0,他引:6
细胞因子α干扰素(IFNα)具有中枢镇痛作用。抗内源性阿片肽血清与IFNα能发生明显的交叉反应,提示IFNα与内源性阿片肽之间存在着共同的抗原决定基。采用基因定点突变技术,获得系列IFNα突变体,并分别测定其免疫学活性和镇痛能力。结果显示,IFNα突变体Y129S-IFNα免疫学活性显著下降,但仍然保留了很强的镇痛能力,阿片受体拮抗纳洛酮能够阻断Y129S-IFNα的镇痛作用。实验结果表明,IFN 相似文献
35.
力竭性运动对大鼠肝脏线粒体氧化磷酸化偶联的影响 总被引:15,自引:1,他引:14
本文以SD大鼠三级递增负荷力竭性跑台运动疲劳模型,分别测定了运动后即刻肝脏线粒体;1.呼吸链复合休Ⅰ+Ⅲ和Ⅱ+Ⅲ电子传递与质子泵出比值。2.以苹果糖酸=谷氨酸和琥珀酸为底物的呼吸控制;态3呼吸速度,态4呼吸速率,呼吸控制率和磷/氧比。结果表明;两种呼吸底物启动的线粒体态4呼吸速率分别升高46.46和23.54%;呼吸链复合体Ⅰ+Ⅲ和Ⅱ+Ⅲ的总H^3/2e分别降低18.63和15.89%。 相似文献
36.
以Nested-PCR方法从人肝cDNA基因文库中扩增出编码人血小板生成素(hTPO)前153个氨基酸的氨基端功能区cDNA;在扩增中,采用非连续多核甘酸定点突变的方法.将翻译起始的七个氨基酸的原核中不常用的密码子同又突变成使用频率较高的密码子,以便于其在大肠杆菌中表达。序列测定证实了预期的结果。 相似文献
37.
天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
利用多聚酶链式反应(PCR)技术,对天然天花粉蛋白(nTCS)基因在Tyr14和Arg22两个保守残基处同时进行定点突变,即Tyr14变成Phe,Arg22变成Leu,然后克隆到pET-8c高效表达载体上,构建成重组质粒pETY14F/R22L.经序列分析,定点突变的结果与预先设计的完全一致,突变后的天花粉蛋白命名为Y14F/R22LTCS.将pETY14F/R22L转化到E.coliBL21(DE3,pLysS)中,进行表达.经CM-SepharoseCL-6B柱纯化,SDS-PAGE鉴定,纯度可达90%.RIP活性测定显示,Y14F/R22LTCS的活性比nTCS降低了7.5倍,活性变化不显著,因此,TCS的Try14和Arg22对维持其活性部位构象并不是必需的.但由于Y14F/R22LTCS在E.coli中的表达量与nTCS相比明显下降,因此,Tyr14和Arg22可能与TCS翻译后的折叠有关. 相似文献
38.
神经-血管偶联机制至今还没有完全被阐明.对脑微循环的研究表明,位于皮层内的微动脉的舒张代表着神经-血管偶联过程中的最初血流响应机制.一氧化氮(NO)被认为是介导微动脉舒张的最重要因子之一,为了探讨NO在微动脉舒张过程中作为关键因子的作用,本文开展了基于大脑功能柱水平,由功能刺激产生的NO在神经-血管偶联过程中扩散动力学的时空模式的仿真建模研究.在大脑功能柱形态分析的基础上,建立NO扩散数学模型.应用该模型,清晰地阐述了由功能刺激产生的NO在时间维度和空间维度的扩散过程.计算机仿真结果表明,由功能刺激产生的NO,其扩散主要被限制在功能柱内.因此,NO作用的影响区域也就被限制在功能柱内.在时间维度上,NO信号大约维持1s左右.本研究从四维时空角度探讨由功能刺激产生的血管舒张因子的响应模式,为最终阐明神经-血管偶联机制提供了一种新的途径. 相似文献
39.
线粒体的呼吸耗氧偶联着ATP的合成,而位于线粒体内膜上的跨膜蛋白解偶联蛋白(uncoupling protein,UCP)能够破坏这种偶联关系.在大肠杆菌中表达了有生物活性的鼠源解偶联蛋白1(rUCP1).重组rUCP1的表达导致大肠杆菌宿主细胞生长变慢;在电子显微镜下观察免疫标记的结果显示,重组rUCP1主要表达在细菌膜上;同时将rUCP1重构到脂质体中也能够测到质子转运活性.这些结果说明,真核生物UCP1能够在原核生物中表达出有生物活性的形式,且能纯化得到足量的rUCP1蛋白用于进一步的结构生物学研究. 相似文献
40.
尿卟啉原Ⅲ甲基化酶是一种新型的红色荧光指示蛋白,但是,在大肠杆菌重组表达的SUMT水溶性相对较低,限制了它的应用范围,而且对于结合在蛋白的色素组分尚不清楚。利用定点突变产生玉米尿卟啉原Ⅲ甲基化酶L88R/L89G双突变体和L166A突变体,两种突变体分别在大肠杆菌中重组表达,Ni-NTA一步纯化。紫外可见光谱扫描和质谱分析确定从纯化的L88R/L89G双突变体蛋白分离的色素组分。L88R/L89G双突变体在大肠杆菌细胞内有酶活,而L166A突变体胞内酶活丧失。结合蛋白的主要组分为三甲基化咕啉。纯化的双突变体蛋白水溶性增加,为提高它作为荧光指示蛋白检测外源融合蛋白的水溶性打下基础。 相似文献