重组人骨形成蛋白—3成熟肽的表达,纯化及诱骨活性的研究

推测人骨形成蛋白３羧基端的１２７氨基酸的肽段为其成熟肽（ｈＢＭＰ３ｍ）。将编码此成熟肽的ｃＤＮＡ插入含ＰＬ启动子的表达质粒ｐＤＨ中,构建表达质粒ｐＤＨＢ３ｍ,转化大肠杆菌ＤＨ５α。４２℃热诱导６ｈ后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白２８％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后,溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在９５％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白３成熟肽（ｒｈＢＭＰ３ｍ）植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的ｒｈＢＭＰ３ｍ具有明显的异位诱骨活性。     

抗人CD3单链抗体四聚体基因的构建及表达

为构建和表达抗人CD3单链抗体 (scFv) 人p5 3四聚功能域融合基因 ,选用人IgG3上游铰链区作为抗人CD3scFv和人p5 3四聚功能域之间连接的linker .利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四聚功能域融合基因 ,克隆入pUC18载体中构建pUC18 IgG3 p5 3克隆载体 .将抗人CD3scFv克隆入pUC18 IgG3 p5 3载体中 ,构建抗人CD3scFv 人p5 3四聚功能域融合基因 .经酶切鉴定及序列测定证实后 ,将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行亲和活性测定 .获得了抗人CD3scFv 人p5 3四聚功能域融合基因 ,基因全长 882bp ,可编码 2 94个氨基酸 ,与已发表的抗人CD3scFv、人IgG3上游铰链区和人p5 3四聚功能域基因cDNA序列一致 .表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约 35kD的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMC)细胞 ,亲和力高于scFv ,为进一步临床应用奠定基础     

人骨保护素(OPG)重组腺病毒的制备及其生物活性研究

采用RT-PCR法得到人OPG的编码区cDNA,克隆至穿梭质粒pShuttle,构建重组有OPG编码区cDNA的腺病毒DNA,经Pac I 酶切线性化,在脂质体介导下转染HEK293细胞,制备重组腺病毒并测定病毒滴度约为5×10⁶～1.5×10⁷ pfu/mL。体外感染小鼠成肌细胞C2C12,Western blot及ELISA检测证实有OPG蛋白的表达,并可在细胞培养上清中持续表达6周。感染OPG重组腺病毒的C2C12细胞生长状态良好、细胞周期无明显变化。将重组腺病毒加入体外培养的小鼠骨髓细胞的培养基中,诱导形成的破骨细胞数量及在象牙片上形成的吸收陷窝的数量显著减少（P<0.01）。      

NDRG2通过调控CD24影响肝癌细胞侵袭能力的研究

目的：阐明NDRG2（N-Myc downstream-regulated gene2）在肝癌细胞中对CD24的调控及其对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法：Western blot检测低转移性的肝癌细胞Huh7、高转移性的肝癌细胞系MHCC97h及正常人肝细胞系L-02中NDRG2和CD24的表达;通过腺病毒载体上调MHCC97h细胞中NDRG2的水平,或利用siRNA下调Huh7细胞中NDRG2的表达,检测CD24的变化以及细胞侵袭能力的改变。结果：MHCC97h细胞中NDRG2基因和蛋白的表达水平低于Huh7细胞,而CD24的表达水平高于Huh7细胞;在MHCC97h细胞中上调NDRG2可以抑制CD24的表达并抑制其侵袭能力,而在Huh7细胞中下调NDRG2的表达可以提高CD24的水平及细胞的侵袭能力。结论：NDRG2可能通过影响CD24参与调控肝癌细胞的侵袭能力。     

TET蛋白去甲基化作用的相关研究进展

TET(ten-eleven translocation)蛋白属于酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶,能够产生催化氧化作用。在TET蛋白家族的催化氧化作用下5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)可转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC),并可进一步转化为5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)。TET蛋白在DNA胞嘧啶的去甲基化、胚胎发育和基因重新编码等过程都存在重要作用,其中TET蛋白参与DNA胞嘧啶的去甲基化过程的作用机制一直是研究热点,另外,有研究发现TET与肿瘤的发生也存在联系,可能成为新的肿瘤分子标志。     

DDR2基因缺失对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的:骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是骨再生工程中重要的种子细胞,它对骨组织缺损的修复有着良好的效果。但是BMSCs向成骨细胞分化并修复骨组织缺损是是由细胞外因子共同作用产生的结果。DDR2(Discoidin Domain Receptor 2)作为I型胶原的特异性受体在成骨细胞的分化中发挥重要的调节作用。而对于其在BMSCs向成骨细胞的分化过程中的所起到的作用还鲜有研究,对其作用机理尚不明确。因此我们希望通过分离、培养并鉴定比较DDR2基因缺失小鼠与野生型小鼠来源的骨髓间充质干细胞了解其生物学特性,为后续的实验奠定理论基础。方法:采用改良型的全骨髓贴壁细胞分离方法分离培养两种小鼠来源的骨髓间充质干细胞,采用流式细胞技术鉴定其表面标记物的表达,并利用诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成脂肪细胞分化。结果:分离培养的两种骨髓间充质干细胞形态一致,增殖能力和自我更新能力强,流式细胞术检测其表面标记物CD29,Sca-1均表达阳性,CD105,CD45表达为阴性,分离得到的两种细胞均有向成骨细胞和成脂肪细胞分化的能力,但可以明显观察到DDR2基因缺失小鼠的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力减弱。结论:本实验通过对于DDR2基因缺失小鼠BMSCs分离、培养和鉴定,初步探索DDR2基因缺失在在成骨过程中的作用结果,为进一步研究提高BMSCs的成骨分化能力奠定理论基础。经实验证明,DDR2基因缺失小鼠来源的骨髓间充质干细胞虽然仍具备干细胞的生物学特性,但其向成骨细胞的分化能力明显减弱,说明DDR2基因缺失对其骨髓间充质干细胞的成骨分化等有着重要的影响。     

人血管生成素-PE40融合蛋白基因的构建、表达及活性研究

利用 PCR扩增出人血管生成素 (h ANG)成熟肽的基因片段 .与绿脓杆菌外毒素缺失突变体PE40的基因连接后 ,克隆入 p UC1 9载体中 .测序后克隆入表达载体 p RSETB,构建成 h ANG-PE40融合基因的表达载体 .IPTG诱导 ,表达出分子量约为 58k D的 His6- ANG- PE40融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 8% .Ni2 +- NTA树脂纯化表达蛋白 ,SDS- PAGE结果显示纯化重组蛋白为单一条带 .鸡胚绒毛尿囊膜鉴定表明重组蛋白体外能够有效地抑制血管的形成 .     

酪氨酸激酶EphB2受体N端球状结构域的表达及纯化

根据酪氨酸激酶ＥｐｈＢ２受体的碱基序列,用ＰＣＲ方法扩增其结合配体的关键结构域Ｎ端球状区,定向克隆到融合表达质粒载体ｒＲＳＥＴ Ａ中,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）。阳性克隆经ＩＰＴＧ诱导,由Ｔ７启动子调控表达了氨基端带６个连续组氨酸残基的融合蛋白。电泳分析表明,表达的融合蛋白主要以包含体的形式存在,约占细菌总蛋白的１４％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹确证,利用Ｎｉ－ＮＴＡ金属螯合亲和色谱法在变性条件下对     

噬菌 展示法筛选与EphB2结合的短肽

酷氨酸蛋白激酶受体ＥｐｈＢ２的Ｉｇ类似区,克隆到融合表达闰载体ｐＥＴ２８ａ中,阳性克隆经ＩＰＴＧ诱导,表达出氨基端带６个连续组氨酸残基的融合蛋白。利用Ｎｉ－ＮＴＡ金属螯合亲和层析法有变性条件下对表达的蛋白进行纯化,纯度大于９４％。以此纯化蛋白为靶,将其包被于ＥＬＩＳＡ板上,经过三轮亲和筛选,从噬菌体随机７肽库中筛选到１９个具有ＥｐｈＢ２活性的重组噬菌体克隆,对阳性噬菌体克隆的短肽序列进行了分析。     

人血管生成素基因的优化表达及活性测定

血管生成素（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ,ＡＮＧ）广泛存在于多种肿瘤组织中,在肿瘤发生的不同刺激新生血管的形成。利用基因工程技术生产血管生成素,对于研究血管生成素的作用机制及寻找抗血管生成素的药物具有重大价值。倡该基因在大肠杆菌中不能直接表达,本文根据原核翻译起序列的局部二级结构自由能设计了ＡＵＧ上下游序列,并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人肺癌细胞系Ａ５４９中扩增出起始区改造的ａｎｇ基因,成功构建了人ＡＮＧ的高