人骨保护素(OPG)重组腺病毒的制备及其生物活性研究

采用RT-PCR法得到人OPG的编码区cDNA,克隆至穿梭质粒pShuttle,构建重组有OPG编码区cDNA的腺病毒DNA,经Pac I 酶切线性化,在脂质体介导下转染HEK293细胞,制备重组腺病毒并测定病毒滴度约为5×10⁶～1.5×10⁷ pfu/mL。体外感染小鼠成肌细胞C2C12,Western blot及ELISA检测证实有OPG蛋白的表达,并可在细胞培养上清中持续表达6周。感染OPG重组腺病毒的C2C12细胞生长状态良好、细胞周期无明显变化。将重组腺病毒加入体外培养的小鼠骨髓细胞的培养基中,诱导形成的破骨细胞数量及在象牙片上形成的吸收陷窝的数量显著减少（P<0.01）。      

基因功能的研究方法

人类基因组计划的顺利进行使基因功能研究成为生命科学领域中的重大课题,基因转导、反义技术、转基因和基因剔除、染色体转导、RNA干涉等是目前研究基因功能的主要方法,新的技术不断涌现,且各有其特点和局限性。     

人Era不同结构域在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

ｅｒａ基因是 1986年在测定大肠杆菌基因组序列时发现的一个开放读框 .由于其编码的氨基酸序列与人及酵母的ＲＡＳ蛋白有部分相似之处 ,命名为Ｅ .ｃｏｌｉＲＡＳ ｌｉｋｅ(ｅｒａ)基因[1] .ｅｒａ基因广泛存在于原核生物中 ,与细胞周期和细胞分裂有关 ,是细菌生存繁殖所必需的重要基因[2 ] .在真核生物如蠕虫、小鼠和人的组织中都发现有与细菌ｅｒａ高度同源基因存在[3 ,4 ] .人ｅｒａ基因 (ｈｅｒａ)的全长ｃＤＮＡ于 1998年被克隆 ,与原核ｅｒａ基因具有很高的同源性[5] .人Ｅｒａ蛋白与大肠杆菌Ｅｒａ蛋白的氨基酸序列有 30 %相同 ,两者…     

人骨形态发生蛋白-2重组腺病毒的构建与制备

将人BMP-2的编码区cDNA克隆至穿梭载体pShuttle,以PI-SceI和I-CeuI切下含BMP-2编码区cDNA的片断,在体外与PI-SceI/I-CeuI切开的腺病毒DNA连接,构建重组有BMP-2全长编码区基因的腺病毒DNA,PCR鉴定正确后,经PacI酶切线性化,在脂质体介导下转染HEK293细胞,反复冻融制备重组腺病毒,空斑形成试验测定病毒滴度约为7.5×106～1.5×107pfu/ml。以BMP-2重组腺病毒感染体外培养的小鼠成肌细胞C2C12,Westernblot检测证实有BMP-2表达。     

人骨保护素成熟肽段基因的克隆和序列测定

人骨保护素（OPG）具有抑制破骨细胞分化、抑制成熟破骨细胞的活性并诱导其凋亡的功能,具有广泛的研究和应用前景。采用RT－PCR的方法从重组骨形成蛋白2（BMP－2）刺激的人骨肉瘤细胞系MG63细胞中克隆编码人OPG的成熟肽段基因,并将其克隆到pUC18中,序列分析结果表明,所克隆的人OPG／OCIF成熟肽段基因与献报道的完全一致。为进一步基因表达及功能研究奠定了基础。     

OPG/RANKL/RANK系统与骨破坏性疾病

近年来发现的OPG/RANKL/RANK系统在破骨细胞生成中起着至关重要的作用,是骨骼生理研究领域的重大进展。成骨细胞、骨髓基质细胞、激活的T淋巴细胞表达RANKL,与破骨细胞前体细胞或成熟破骨细胞表面上的RANK结合后,促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。成骨细胞及骨髓基质细胞分泌表达OPG可与RANKL竞争性结合,从而阻断RANKL与RANK之间的相互作用。体内多种激素或因子通过影响骨髓微环境内的OPG/RANKL比率来调节骨代谢。此外,乳腺上皮细胞表达有RANK,孕期在性激素的诱导下可表达RANKL,OPG/RANKL/RANK系统在孕期乳腺发育以及母体向胎儿的钙转运过程中发挥重要作用。阻断RANKL/RANK通路有望给骨质疏松、类风湿关节炎及癌症骨转移等骨破坏性疾病的治疗开辟新的途径。进一步研究应了解OPG/RANKL/RANK系统与其它信号传导途径的关系,重视骨骼、免疫及内分泌系统之间的相互作用。目前,开发与OPG功能相似或促进其表达的合成药物有可能成为具有良好经济效益和社会效益的产业。     

嵌合重组caspase-3诱导表达促进肿瘤细胞凋亡

通过稳定转染人宫颈癌HeLa细胞,建立了野生型caspase-3（wt-casp3）,大小亚基序列颠倒的重组caspase-3 (r-casp3),和N端融合绿脓杆菌外毒素（PE）转膜肽段的嵌合重组caspase-3 (cr-casp3)的诱导表达细胞系.蜕皮素诱导后细胞中检测到目的基因的表达,MTT检测和细胞计数结果表明,r-casp3和cr-casp3诱导表达后有效地导致HeLa细胞死亡,通过测定细胞中caspase-3活性,以及细胞周期检测、DNA梯状电泳条带检测(DNA ladder)、电镜观察等证实r-casp3和cr-casp3诱导表达后细胞发生了凋亡,且二者的促凋亡活性相当,而wt-casp3诱导表达细胞并未出现上述效应.结果表明,与野生型caspase-3活化需要上游分子的切割不同,重组caspase-3具有自发的促凋亡活性,而N端PE肽段的融合不影响这种活性,因此PE转膜结构域和重组caspase-3有望参与构建能转膜进入细胞内部,并杀伤细胞的新型肿瘤治疗分子.     

骨形成蛋白诱导型真核载体的构建及其表达

成骨分化相关基因骨钙素 (OC)等的启动子内均含有成骨特异性转录因子Cbfa1特异性作用元件 ,而骨形成蛋白 (bonemorphogeneticprotein ,BMP)的促成骨分化作用正是通过其首先引起Cbfa1的升高 ,而后Cbfa1激活这些基因的表达 ,最终出现成骨分化表型 .为解决BMP没有理想的活性测定方法的问题 ,在RT PCR结果证实BMP 2可促进NIH3T3和C2C12细胞Cbfa1表达后 ,构建了串联6个Cbfa1作用元件的小鼠OC部分启动子 (6OCP)控制萤光素酶 (luciferase)报告基因的真核表达质粒 ,以期来放大BMP诱导报告基因表达的作用效果 .即通过细胞转染、rhBMP 2刺激后检测萤光素酶活性变化 ,从而间接定量测定rhBMP 2的生物学活性 .结果表明 ,pcDNA3 6OCP Luc转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3 Luc大为降低 ;而且在一定剂量范围内 ,转染细胞的萤光素酶活性 (荧光值 )随rhBMP 2剂量增加而升高 ,并呈线性正相关 ,为建立BMP活性定量测定的方法打下基础     

人骨保护素在毕赤酵母中的分泌表达及表达产物的生物活性分析(英文)

为了在毕赤酵母表达系统中分泌表达人骨保护素 (osteoprotegerin ,OPG) ,以人骨肉瘤细胞系MG6 3的mRNA为模板 ,采用RT PCR法得到人OPG编码区cDNA ,克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ B ,电转化毕赤酵母GS115 (Mut+) ,经 3%甲醇诱导分泌表达人OPG与组氨酸的融合蛋白 .SDS PAGE及Western印迹分析表明 ,有分子量约 6 6kD的目的蛋白表达 .纯化后的表达产物加入体外培养的小鼠骨髓细胞培养基中 ,当浓度为 10 0ng ml时 ,象牙片上骨吸收陷窝的数量及玻片上的TRAP阳性多核细胞的数量均减少 (P <0 0 5 ) .而同时加入人OPG的多克隆抗体后 ,这一抑制作用可被拮抗 ,在浓度为 5 0ng ml时则无此作用 .人OPG蛋白在酵母系统的成功表达 ,为该蛋白的进一步应用研究提供了依据 .     

人era真核表达载体的构建

Era是一个独特的含有RNA结合KH结构域的G蛋白亚家族,哺乳类era新近被克隆,目前还没有关于其功能的研究报道。构建了带流感病毒血凝素9肽表位标签（HA tag）的野生型人era基因的真核表达载体,瞬时转染体外培养细胞CHO,Western blot鉴定表明目的的基因得到表达。为深入探讨人era基因的功能奠定了坚实的基础。