人骨形态发生蛋白-2重组腺病毒的构建与制备

将人BMP-2的编码区cDNA克隆至穿梭载体pShuttle,以PI-SceI和I-CeuI切下含BMP-2编码区cDNA的片断,在体外与PI-SceI/I-CeuI切开的腺病毒DNA连接,构建重组有BMP-2全长编码区基因的腺病毒DNA,PCR鉴定正确后,经PacI酶切线性化,在脂质体介导下转染HEK293细胞,反复冻融制备重组腺病毒,空斑形成试验测定病毒滴度约为7.5×106～1.5×107pfu/ml。以BMP-2重组腺病毒感染体外培养的小鼠成肌细胞C2C12,Westernblot检测证实有BMP-2表达。     

悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的实验研究

利用5L生物反应器悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus-green fluorescent protein,Ad-GFP),为规模化生产腺病毒基因药物建立一种稳定可行的生产工艺。复苏的种子细胞进行逐级放大最后接入5L搅拌式生物反应器中,采用含5％胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培基灌流培养293 N3S细胞,当细胞密度达到(2～4)×10⁶个/mL时感染Ad-GFP,48h后收获细胞,经两步氯化铯超速离心获得纯化的Ad-GFP。采用紫外分光光度计比色法和高压液相色谱法（HPLC）测定病毒颗粒数和纯度,采用组织培养半数感染剂量（TCID₅₀）法检测腺病毒的感染滴度。连续培养10～12d,细胞密度可达到(2～4)×10⁶6个/mL左右,纯化的Ad-GFP感染滴度和颗粒数分别为1.0×10¹¹IU/mL和1.68×10¹²VP/mL,比活性为6.0%,A₂₆₀A₂₈₀比值为1.33,产品纯度达到99.2%。建立了5L生物反应器悬浮培养293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的生产工艺,对携带其他基因的重组腺病毒药物生产具有一定的指导意义。     

腺病毒介导的uPAR反义核酸转移抑制肿瘤细胞的侵袭

为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPAR cDNA 5′端－46 bp～＋454 bp一段长500 bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno-X中, 构建出重组腺病毒载体pAdeno-X-uPAR(－)和pAdeno-X-uPAR(+).线性化后的重组腺病毒载体转染HEK293细胞7天后,可以获得滴度分别为1.5×10⁸ pfu/ml和0.5×10⁸ pfu/ml的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒,分别命名为Ad-uPAR(－)和Ad-uPAR(+).以不同的病毒感染指数（MOI）感染人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞,3天后用RNA印迹法可以检测肿瘤细胞uPAR正义和反义核酸表达水平,随着MOI的升高,Ad-uPAR(－)感染的肿瘤细胞uPAR蛋白水平逐渐下降,肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降,而感染Ad-uPAR(+)的肿瘤细胞无明显变化.结果表明,重组腺病毒可以表达uPAR正义和反义核酸,uPAR反义核酸可以明显抑制人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力.     

重组人粒细胞集落刺激因子Cdna在哺乳动物细胞中高效表达的研究

利用PCR反应、DNA测序、基因重组等技术,构建了两个表达人粒细胞集落刺激因子cDNA的重组质粒pED－GCSF和pEF－GCSF,两质粒分别转染COS7细胞作瞬时表达,转染CHO－dhfr－细胞作稳定表达。结果两质粒在COS7细胞和CHO细胞均获得了表达,pED－GCSF转染COS7细胞48h、72h的表达量分别为5.2×10⁴pg/ml和2.3×10⁵pg/ml,pEF－GCSF转染COS7细胞后48h、72h的表达量分别为2.8×10⁵pg/ml和1.4×10⁵pg/ml。转染CHO－dhfr－细胞,随着加入的氨甲喋呤(MTX)浓度升高,CHO－dhfr+克隆数减少,但平均每个克隆的rhG－CSF表达量升高,在0.5μmol/L MTX下最高表达rhG－CSF细胞株的量是4.46μg/ml/3d。且表达的rhG－CSF注射小鼠腹腔可提高小鼠外周血白细胞的数量。     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

含人纤溶酶原K5基因的腺病毒载体制备和功能研究

应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5 cDNA基因,与真核表达载体pcDNA3重组,形成重组质粒pcDNA3K5,与穿梭质粒pShuttle 重组得pShuttleK5,经与腺病毒DNA重组,PCR鉴定正确,即为pAdK5。脂质体法将其转染293细胞后,制备细胞裂解液;噬斑分析法测定病毒滴度为5×10⁸ pfu/mL。将病毒以不同的感染系数(MOI)感染人脐静脉内皮细胞株ECV304和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MTT法检测两者的增殖情况：ECV304细胞增殖受抑制,而MDA-MB-231细胞增殖未受明显影响。将感染病毒的ECV304细胞接种于ECMatrix^TM胶,显示内皮细胞分化和毛细血管管腔形成受抑制。表明所构建的含人纤溶酶原K5基因的重组复制缺陷型腺病毒具有抑制ECV304细胞增殖、分化和管腔形成的作用而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

腺病毒载体介导CEA基因元件调控自杀基因治疗

构建以CEA启动子控制HSV-TK基因表达的复制缺陷型腺病毒载体(AdCEATK).纯化的重组腺病毒滴度达1×10¹²pfu/ml.CEA阴性的HeLa细胞感染AdCMVTK后对丙氧鸟苷(GCV)很敏感,而感染了AdCEATK后不被GCV杀伤.与此相反CEA阳性的LoVo细胞中AdCMVTK和AdCEATK都有很好的表达活性,说明CEA启动子有良好的细胞专一性.AdCEATK/GCV系统还有明显的旁杀伤效应.此载体将有助于实现对CEA阳性肿瘤的专一性自杀基因治疗.     

柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

用建立表达性文库的方法 ,构建了Eimeriatenella孢子化卵囊噬菌体ZAP表达性cDNA文库。首先用TRIzol试剂盒从E .tenella孢子化卵囊中提取总RNA ,再用Oligo(dT)₁₂纤维素柱从总RNA中分离mRNA ,以mRNA为模板 ,Oligo(dT)₁₈Linker Primer为引物 ,反转录合成cDNA第一链 ,再在DNA聚合酶Ⅰ作用下置换合成第二链cDNA。cDNA第二链合成后用PfuDNA聚合酶补平XhoⅠ位点 ,再与EcoRⅠAdapters连接 ,经XhoⅠ酶切后 ,凝胶电泳回收 500bp～4.0kp之间的cDNA片段 ,纯化后的双链cDNA与载体ZAPExpressvector连接。体外包装后得到E .tenella孢子化卵囊的cDNA表达性文库 ,经测定该文库的容量为 6×10⁶ ,扩增后文库的滴度为 1×10¹¹ Pfu mL ,经PCR测定 ,该文库的重组率为 96%。     

人Sema4C重组腺病毒载体的构建及其在小鼠成肌细胞系C2C12中的表达

利用Ad5腺病毒载体系统构建人Sema4C基因重组腺病毒表达载体并在成肌细胞系C2C12中表达,并初步探讨Sema4C基因在成肌发育过程中的可能作用。利用脂质体介导重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装出完整的腺病毒;将重组腺病毒载体感染C2C12成肌细胞后,利用激光共聚焦显微镜观察发现12h即有绿色荧光表达,24h后绿色荧光蛋白表达最强;流式细胞仪检测病毒的感染效率几乎达100%。WB检测结果表明感染重组腺病毒载体组C2C12细胞Sema4C蛋白的表达量明显高于空载体对照组（P<0.01）。为了进一步观察Sema4C基因对C2C12细胞增殖分化的影响,流式细胞仪检测了病毒感染48h后C2C12细胞的增殖指数,并对感染后诱导分化的C2C12细胞的分化情况进行了观察。我们的结果首次表明,过表达外源性人Sema4C基因不仅能使C2C12细胞的G0/G1期比例增加,细胞的增殖指数下降,同时在分化培养条件下还能促进C2C12细胞肌管的形成。     

Inhibition of CXCR4 expression by recombinant adenoviruses containing anti-sense RNA resists HIV-1 infection on MT4 cell lines

CXCR4-tropic (X4) variants are associated with faster disease progression than CCR5-tropic variants in HIV infection. We previously reported inhibition of CCR5 expression on U937 cells could protect the cells from HIV-1 infection. Here, we established recombinant adenoviruses containing anti-sense CXCR4 cDNA, to investigate its role in the protection of HIV entering into target cells. A fragment of 636 bp cDNA from CXCR4 mRNA was recombined into adenoviral vector and the recombinant adenovirus was obtained from AD-293 cells. The rates of CXCR4 expression on the MT4 cells infected with recombinant adenovirus were measured by FACS. The MT4 cells infected by recombinant adenovirus were challenged by T-tropic HIV-1 strains and then P24 antigen was assayed. The rate of expression of CXCR4 on MT4 cell infected with recombinant adenovirus was decreased from 42% to 1.12% at 24 h, and to 1.03%, 1.39%, and 1.23% at 48 h, 72 h and 10 days respectively. Compared with Ad-control cells, recombinant adenovirus infected MT4 cells produced much less P24 antigen after being challenged with HIV-1. Furthermore, the recombinant adenovirus had no effects on chemotactic activity and proliferation of the MT4 cells. In conclusion, recombinant adenoviruses containing anti-sense can inhibit CXCR4 expression and resist HIV-1 infection on MT4 cell lines.     

Over expression of bone morphogenetic protein-3b (BMP-3b) using an adenoviral vector promote the osteoblastic differentiation in C2C12 cells and augment the bone formation induced by bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in rats

BMP-3b is a novel BMP-3-related protein and its biological functions are unknown. In order to investigate the biological actions of BMP-3b, we constructed a BMP-3b-expressing recombinant adenoviral vector (AxCAKBMP-3b). We show that over expression of BMP-3b stimulated the induction of differentiation and the osteoinduction activity of a human BMP-2-expressing recombinant adenoviral vector (AxCAOBMP-2). C2C12 cells were infected in vitro with AxCAKBMP-3b, AxCAOBMP-2 and a control vector containing no foreign genes (AxCAwt). Cells infected with AxCAOBMP-2 and AxCAKBMP-3b produced more alkaline phosphatase and secreted more osteocalcin into the culture medium than cells infected with AxCAOBMP-2 and AxCAwt. When AxCAOBMP-2, AxCAKBMP-3b, and AxCAwt were injected into the calf muscles of nude rats (F 344/N Jcl-rnu), the osteoinduction seen with AxCAOBMP-2 and AxCAKBMP-3b was greater than that seen with AxCAOBMP-2 and AxCAwt.     

表达丙型肝炎病毒NS3抗原的重组腺病毒构建及体外表达

为探索研制丙型肝炎疫苗的新途径,以期获得防治丙型肝炎的重组腺病毒减毒活疫苗,我们构建了表达丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus ,HCV)非结构蛋白3(non structural protein 3,NS3)抗原的重组腺病毒RAd NS3,并检测其在体外表达。应用PCR从真核表达质粒pRC/NS3 中扩增编码HCV NS3 蛋白(329-935aa)的基因片段,定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带HCV NS3基因的重组腺病毒基因组质粒pAd HCV NS3,转染293 细胞,成功包装出重组腺病毒RAd NS3,利用它有效地感染人肝癌细胞株HepG2,经RT PCR及免疫印迹等不同方法检测表明,被感染细胞能表达HCVNS3蛋白,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗HCV免疫应答能力的研究奠定了基础。     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G1基因重组腺病毒载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

拟构建汉坦病毒Gl基因重组腺病毒载体并在VeroE6细胞中表达,为汉坦病毒基因疫苗的研究提供实验基础。PCR法从含汉坦病毒-76118株M基因的M56质粒扩增糖蛋白G1基因片段,利用穿梭质粒pShuttle,将其克隆入Adeno—X病毒DNA,获得重组腺病毒DNA,转染HEK293细胞,包装、扩增后得到汉坦病毒Gl基因重组腺病毒原种,感染VetoE6细胞,用IFA法和ELISA法检测表达产物。得到了含汉坦病毒G1基因的重组腺病毒,其滴度约为10^11pfu／ml,感染VeroE6细胞后检测到汉坦病毒糖蛋白G1的表达。     

DN-AMPK腺病毒载体的构建及其在小鼠成肌细胞系C2C12肌管分化中的影响

在研究AMPK的调控网络时,通常利用过表达显性失活突变型AMPK(dominant negative AMPK,DN-AMPK)作为研究手段来验证AMPK在某些重要生理病理调节通路中的关键作用。旨在利用Ad5腺病毒载体体系构建Ad-DN-AMPK表达载体,并在成肌细胞系C2C12中检测无活性AMPK高表达后对C2C12细胞分化为肌管细胞的影响。通过构建AMPKα1(D159A)和AMPKα2(K45R)的腺病毒表达载体,在HEK293细胞中成功包装并扩增出完整的腺病毒,待其感染能力基本稳定后,将腺病毒感染C2C12,利用激光定量成像仪检测其感染滴度,感染效率能高达100%,并且能够持续表达6 d。DN-AMPK高表达后,AMPK常用激活剂A769662(SN-5)不能激活AMPK,表现为AMPK下游蛋白活性丧失,如ACC磷酸化无变化。通过实时定量PCR的方法,检测DN-AMPK对C2C12分化为肌管细胞的影响,结果表明过表达DN-AMPK能够促进C2C12细胞分化为肌管细胞的标记蛋白(Myod和Myogenin)的表达,即促进C2C12分化为肌管细胞。     

人成纤维细胞生长因子受体2IIIc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。     

Expression of bone morphogenetic protein-2 via adenoviral vector in C2C12 myoblasts induces differentiation into the osteoblast lineage.

To examine the effectiveness of a gene transfer of bone morphogenetic protein (BMP)-2 into C2C12 myoblasts, we constructed a human BMP-2-expressing replication-deficient adenoviral vector, AxCAOBMP-2. C2C12 cells were infected in vitro with either this viral vector or an Escherichia coli LacZ gene-expressing control adenovirus vector. An efficient gene transfer to the C2C12 cells was confirmed with the LacZ gene-expressing vector by X-gal staining. Abundant BMP-2 expression in C2C12 cells infected with this viral vector was confirmed by immunofluorescence and Western blot analysis. C2C12 cells transferred with the BMP-2 gene by this vector produced alkaline phosphatase in the cells and also produced and secreted osteocalcin in the culture medium, demonstrating that a gene transfer of BMP-2 into C2C12 cells in vitro could convert these cells from myoblast to osteoblast lineage.     

鼠重组磷脂酶D2腺病毒的构建及功能的初步研究

将磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D2基因及其功能缺陷点突变基因 (K75 8R)从真核表达载体pCGN中克隆至带有绿色荧光标记蛋白的穿梭质粒pAdTrack CMV中 ;再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组 ,成功构建磷脂酶D2重组腺病毒。该病毒颗粒感染人胚肾 2 93细胞 ,高效表达磷脂酶D2及其功能缺陷蛋白。这种表达对M3乙酰胆碱受体介导的细胞内磷脂酶D激活无影响。但磷脂酶D2功能缺陷蛋白对蛋白激酶C介导的胞内磷脂酶D激活有显著抑制作用 ;相反 ,磷脂酶D2蛋白有显著增强作用。结果表明