腾冲嗜热厌氧杆菌Cas2原核表达及生物信息学分析

为研究CRISPR/Cas系统及其相关蛋白Cas2(TTE2657)在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应中的作用,应用PCR技术构建了原核重组质粒pET-28a::cas2,并在大肠埃希菌BL21表达Cas2蛋白;结合生物信息学软件对cas2编码蛋白的基本理化性质、氨基酸同源性、空间结构及蛋白质相互作用网络进行预测和分析。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-28a::cas2并在大肠埃希菌BL21中得到表达,Cas2分子质量大小为9.9 ku,主要以可溶性形式存在;qRT-PCR显示cas2 mRNA在60℃和75℃高表达;生物信息学分析显示cas2基因其完整的ORF全长264 bp,编码88个氨基酸,其中Ile(14)、Ser(14)、Phe (12)含量较高,等电点为9.31,不存在跨膜结构。其蛋白质二级空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主,蛋白互作预测网络显示Cas2与Cas3、Cas5、Cas7等其家族大部分蛋白存在相互作用。进化树分析显示腾冲嗜热厌氧杆菌cas2基因与厌氧菌芽胞杆菌B7M1同源性最高(39.5%)。腾冲嗜热厌氧杆菌cas2编码蛋白是一种亲水性蛋白,在原核系统能高效表达。本研究为嗜热蛋白质的热稳定性机制的研究提供参考。     

阿特拉津降解菌ATR3的分离鉴定与土壤修复

阿特拉津因效率高、价格低廉,是我国玉米田施用最广泛的除草剂之一,但其结构稳定,残留时间长,因此对生态环境和人类健康造成了一定的危害。从长期受阿特拉津污染的玉米田土壤中筛选并鉴定阿特拉津降解菌,明确其在不同类型土壤中的去除能力。对分离出的阿特拉津降解菌ATR3进行生理生化分析和16S rRNA序列鉴定,确定菌株ATR3为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。该菌株以阿特拉津为唯一氮源,培养48 h后对1 000 mg/L阿特拉津的去除率达到97%以上。敏感作物盆栽试验结果表明,阿特拉津在棕壤上去除最快,褐土次之,黑土最慢,说明阿特拉津在土壤中的去除过程与土壤本身的理化性质呈相关关系。同时,该菌株处理14 d后,能明显恢复玉米的各项生物学指标,说明该菌株对阿特拉津污染土壤具有良好的修复能力。为阿特拉津降解菌剂的推广利用提供参考。     

环境温度和体型大小对花绒寄甲成虫死亡率及产卵量的影响

[目的]花绒寄甲Dastarcus helophoroides是天牛类林木蛀干害虫的主要天敌昆虫,为提升花绒寄甲的人工繁育技术和繁育质量,在不同环境温度下,测试了不同体型大小的花绒寄甲对成虫死亡率和产卵量的影响.[方法]按成虫体型大小将花绒寄甲分成较大、较小和中等3组,根据前期不同温度下的饲养经验,分别测试成虫在20、24和28℃下的存活率和产卵量.[结果]体型相同的个体随环境温度升高死亡率增加;20℃时体型小的死亡率高,24℃和28℃各组死亡率无显著性差异;中等个体组在24℃和28℃下的产卵量大于在20℃下的产卵量;同一温度条件下,体型显著影响雌虫的产卵量,体型大者产卵量高.[结论]体型大小对成虫死亡率影响不明显,但对产卵量有较大影响.     

西伯利亚蝗抗菌肽基因的克隆及表达特性研究

[目的]扩增西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus抗菌肽(attacin)基因,并对其进行生物信息学分析,同时分析西伯利亚蝗不同组织中抗菌肽基因的差异表达.[方法]基于RACE技术从西伯利亚蝗中克隆得到抗菌肽,利用生物信息学软件对西伯利亚蝗抗菌肽的一级结构、二级结构、三级结构、系统进化和亚细胞定位进行分析.采用实时荧光定量PCR技术检测了西伯利亚蝗抗菌肽基因在马氏管、中肠、后肠、脂肪体和唾液腺中的相对表达量.[结果]克隆获得的抗菌肽基因的开放阅读框为282 bp,编码93个氨基酸,其编码蛋白预测理论分子量为9.98 ku,等电点为9.26.抗菌肽氨基酸序列中存在信号肽序列.基因定量分析显示,抗菌肽基因在西伯利亚蝗的中肠中表达量最高.[结论]attacin在西伯利亚蝗成虫不同组织中差异表达,提示其消化道在防御病原微生物的入侵中起着重要的作用.     

RGMb/DRAGON与BMP信号转导

RGMb/DRAGON为RGM家族成员之一,在许多组织和器官中存在并表达.最初它作为粘附分子在神经系统中调节轴突排斥被发现.近来研究发现,它还是BMP的辅助受体,与BMP配体和受体结合,通过调控BMP信号通路在繁殖、肾脏机能的维持以及免疫疾病等生理和病理条件下发挥重要作用.本文评述了RGMb的基因及蛋白结构特征、表达定位及其在神经系统中的作用,并重点介绍了其在BMP信号通路中的作用机制和生物学研究进展.     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定

以单核细胞增生李斯特菌细胞碎片免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法成功筛选获得2株稳定分泌抗LM的单克隆杂交瘤细胞株4A7、4H11.抗体效价为1∶160 000以及1∶20 000,亚型为IgG1、IgG2a,Dot-ELISA结果表明4A7和4H11单克隆抗体具有很好的属特异性,Western blot分析表明4A7、4H11抗体分别与单核细胞增生李斯特菌62 kDa以及32 kDa外膜蛋白抗原表位结合,胶体金免疫电镜实验进一步确证以上抗体可有效识别单核细胞增生李斯特菌细胞表面抗原.     

交感皮肤反应在糖尿病周围神经病变诊断中的应用

糖尿病周围神经病变（Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN）是糖尿病最常见的并发症之一。由于目前DPN发病机制不清楚、治疗效果不理想,故早诊断、早治疗显得至关重要。有研究指出交感神经皮肤反应（Sympathetic Skin Response,SSR）可作为评价2型糖尿病患者早期周围植物神经功能状态的指标。本文对SSR应用于DPN临床诊断中的检测技术、观测参数进行综述,发现多数研究中指出,在临床应用中SSR波形、波幅以及潜伏期指标的异常率常受到多种因素的影响、会发生很大波动,而电位曲线下面积减少值相对稳定。据此笔者建议在DPN早期临床诊断中以SSR电位曲线下面积减少作为关键参数,辅助参考SSR波形、波幅以及潜伏期指标进行诊断。     

类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征

从类芽胞杆菌Paenibacillus sp.WZ008的发酵上清液中纯化得到一个高活力碱性果胶裂解酶,经SDS-PAGE电泳估算其亚基相对分子质量为4.5×104。通过对该酶进行酶学性质研究发现：该酶能催化裂解果胶酸、低酯果胶和高酯果胶;酶催化反应最适温度范围为55～60℃,最适pH为9.6,在最适条件下以低酯果胶为底物酶的比酶活达3 021.6 U/mg;Ca2＋能增强该酶的活力,而Mn2＋,Ba2＋和EDTA强烈抑制该酶活力;当没有Ca2＋存在时,高度酯化的果胶是该酶的最适底物,在4 mmol/L Ca2＋存在时,该酶以果胶酸为底物比酶活最高（25 467 U/mg）。该酶N端序列比对分析发现与类芽胞杆菌Paenibacillus amylolyticus strain 27c64果胶裂解酶高度同源。