免疫磁珠分离技术联合流式细胞术检测ENU致大鼠体内Pig-a基因突变

目的结合免疫磁珠分离技术和流式细胞术两种方法,对大鼠外周血突变型红细胞进行富集和检测,优化大鼠外周血Pig-a基因突变试验方法。方法用20、40和80 mg/(kg·bw)剂量的N-乙基-N-亚硝基脲(Nethyl-N-nitrosourea,ENU)连续3 d给予SD大鼠,在染毒前、染毒后第7、14和28天分别采集大鼠外周血,经免疫磁性分离柱富集RET~(CD59-)和RBC~(CD59-),用流式细胞术分别对免疫磁珠分离柱前和柱后的外周血红细胞进行计数。结果与对照组相比,ENU各剂量组的RET~(CD59-)和RBC~(CD59-)发生率均显著升高(P0.05);采用免疫磁珠分离技术后,可以在3 min内完成一个样品的Pig-a基因突变检测,分析的RET~(CD59-)或RBC~(CD59-)细胞数量分别最高可达2×10~4个或9×10~4个。结论本研究联合运用免疫磁珠分离术和流式细胞术,建立并优化了大鼠体内Pig-a基因突变试验方法,实现了高通量检测,提高了试验的准确性和效率。     

豹猫体细胞建系及其生物学特性分析

研究体外培养豹猫(Prionailurus bengalensis)细胞的形态、细胞贴壁率、冷冻存活率、生长曲线及细胞核型等生物学特性,为深入开展豹猫基因组学及濒危野生动物保护提供依据。本实验选择豹猫3种组织,即剑状软骨、心和肺,采用组织块贴壁培养法进行体细胞的原代培养;酶消化法完成细胞的传代培养;程序降温完成细胞的冷冻保存;通过细胞计数法计数细胞冷冻存活率;绘制细胞生长曲线;采用常规染色体标本制备技术,对豹猫的染色体核型及G带进行分析。细胞原代培养结果显示,剑状软骨组织在培养第3天出现纤维样细胞、培养6~7 d铺满培养瓶;心组织在培养第5天出现上皮样细胞、12 d铺满培养瓶;肺组织在培养4 d后出现成纤维细胞、8~9 d铺满培养瓶。3种来源体细胞均显示成纤维细胞特征,剑状软骨源细胞最易贴壁、肺源细胞次之、心源细胞最弱。对比3种不同来源体细胞从6代(P6)至12代(P12)冷冻存活率,剑状软骨源细胞冷冻存活率显著下降(冻存前91.0%~97.6%,冻存后76.8%~85.5%,P0.05),心源细胞冷冻存活率亦显著下降(冻存前82.7%~88.1%,冻存后43.7%~80.5%,P0.05),肺源细胞冷冻存活率有下降趋势,但无显著差异(冻存前83.4%~96.8%,冻存后73.9%~93.3%,P0.05)。生长曲线分析显示,3种体细胞均呈"S"型,其中剑状软骨源细胞增殖最快、肺源细胞次之、心源细胞最慢。核型分析结果显示,3种不同来源的成纤维体细胞染色体数目均为2n=38,18对为常染色体,形态类型为6m+10sm+2st,1对为性染色体,X染色体形态类型为m。本研究建立了3种组织来源的豹猫成纤维细胞建系技术及体细胞系,揭示了该物种成纤维细胞的基本生物学特性,为动物遗传信息研究及豹猫保护提供了重要的实验材料和基础信息。     

室内饲养梨小食心虫幼虫脱果动态

为掌握不同果实室内饲养梨小食心虫Grapholita molesta(Busck)的效果及幼虫脱果的动态,以新红星苹果、富士苹果和大金星山楂饲养梨小食心虫,逐日记载幼虫脱果数量,并进行逻辑斯蒂(logistic equation)曲线拟合。结果显示,相同接卵数和相同饲料重量的情况下,3种饲料得到的幼虫数量高低次序为:新红星苹果>红富士苹果>大金星山楂。其中,新红星苹果每千克产虫量为27.7头,显著高于其它两种饲料。经逻辑斯蒂方程拟合可知,两种苹果幼虫脱果各时期及盛期历期相差较小;而以山楂饲喂的幼虫脱果各时期均比苹果饲喂的梨小食心虫提前4⁵ d,但盛期历期均为6 d左右。由此可知,梨小食心虫幼虫脱果动态可能与寄主水果种类关系较大,而与同种水果不同品种关系较小,这也可能是造成梨小食心虫各代发生重叠及混栽园受害严重的原因。因此,本研究不仅对在室内饲养梨小食心虫具有指导作用,且为测报防治田间脱果幼虫时间提供依据。     

颅内感染患者血清和脑脊液降钙素原水平的观察

目的 研究降钙素原(PCT)在脑膜炎患者血清和脑脊液(CSF)中的水平,探讨其在脑膜炎诊断中的临床意义.方法 用免疫透射比浊法测定42例脑膜炎患者(细菌性脑膜炎18例、病毒性脑膜炎24例)急性期内血清和脑脊液PCT,并与CSF的常规生化指标作相关性分析;20例神经系统非感染性疾病为对照组.结果 细菌性脑膜炎患者血清和CSF中的PCT含量均显著高于病毒性脑膜炎和对照组(P＜0.01);但病毒性脑膜炎患者与对照组之间的PCT水平差异无统计学意义(P＞0.05).相关性分析显示,在CSF中PCT与白细胞数(r=0.161,P＞0.05)无明显相关性,但与CSF蛋白含量和血清PCT水平呈弱相关性(r=0.465和0.570,P＜0.05).结论 PCT升高是颅内细菌感染的标志之一;PCT可作为一项CSF的常规生化指标,有助于指导临床对脑膜炎的诊治.     

皮壳青霉原生质体制备及其形成方式研究

通过对溶壁酶液浓度、酶解时间、酶解温度、菌体预处理方法等因素的实验研究,获得了一种制备皮壳青霉原生质体的有效方法。最佳条件为超声法预处理(300 W,28℃,20 min)的菌体材料,采用10 mg/mL的酶解液34℃酶解作用4 h,此条件下原生质体的形成量达到4.71×106个/mL。同时对原生质体的形成释放方式进行了跟踪观察,发现了包括顶端释放、侧位释放、菌丝段端位释放和原位释放以外的另一种全新的类似酵母"出芽"的释放形式。     

快速诱导细胞凋亡及检测方法研究

目的：探讨Ca2＋和Na＋诱导细胞凋亡的最佳浓度及时间,并用甲基绿一派诺宁染色法检测凋亡细胞的形态变化。方法：分别用不同浓度梯度及时间梯度的Ca2＋和Na＋胁迫处理洋葱鳞茎内表皮细胞,得诱导的最佳浓度及时间;用甲基绿一派诺宁染色法检测诱导凋亡的洋葱鳞茎内表皮细胞、大蒜根尖细胞和鸡血红细胞的形态特征变化。结果：诱导处理的最佳Ca2＋和Na＋浓度为0．4mol／L,最适时间约为8h,且CaCl2的诱导效果较NaCl好;经甲基绿一派诺宁染色,洋葱鳞茎内表皮细胞、大蒜根尖细胞、鸡血红细胞凋亡细胞的细胞核均呈蓝紫色,细胞质呈红色。结论：找出了诱导细胞凋亡的最适Ca2＋和Na＋浓度和时间,并检测到细胞凋亡。     

Ⅰ型前胶原氨基端肽化学发光免疫分析检测方法的建立及评价

为了建立定量检测人血清中Ⅰ型前胶原氨基端肽 (Type Ⅰ procollagen N-terminal peptide,PINP) 的化学发光免疫分析检测方法,首先在谷氨酸棒状杆菌中分泌表达了PINP-α1链重组蛋白,以其为免疫原制备单抗,获得了2B10、8C12和1F11共3株可稳定分泌抗PINP-α1链的单抗杂交瘤细胞株。进一步配对筛选后,以单抗8C12偶联生物素作为捕获抗体,单抗1F11标记辣根过氧化物酶作为检测抗体,二者与样本中的PINP结合形成夹心复合物,再与包被有链霉亲和素的磁微粒形成完整的检测系统,从而定量检测人血清中PINP的浓度。对该方法进行条件优化后,确定捕获抗体、检测抗体的最佳工作浓度均为3 μg/mL,孵育时间为30 min;本方法的最低检测限为1.22 ng/mL,批内、批间的变异系数均在10%以内,线性范围为5–1 100 ng/mL,回收率在93%–107%之间。通过对160份临床样本进行检测,本方法检测结果与罗氏诊断试剂盒检测结果的相关系数R2为0.906 2。开发的磁微粒化学发光免疫分析检测方法可定量检测人血清中PINP的含量,有望成为骨骼疾病检查的辅助手段。     

蔗糖输入对凡纳滨对虾养殖系统真核微生物群落的影响

利用18S rRNA基因高通量测序, 研究蔗糖输入条件下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖系统中水体与絮团的真核微生物群落组成及其相互作用关系。结果表明, 输入蔗糖能显著改变对虾养殖系统中真核微生物群落组成, 促进水体中纤毛虫和轮虫的生长, 对水体绿藻的过度生长有一定抑制作用。Mantel分析发现, 在第28天时, 蔗糖添加以及系统中的溶解氧、亚硝酸盐和磷酸盐对真核微生物群落结构变异有显著影响。利用共线性网络分析表明碳氮比的增加可以增强水体和絮团中不等鞭毛类、纤毛虫和轮虫的相互作用, 对养殖体系中藻类的过度繁殖具有一定的抑制作用。研究揭示了在蔗糖输入条件下凡纳滨对虾养殖系统中真核微生物群落的演替规律及絮团和水体微生物相互作用特征, 为生物絮团技术持续稳定的应用于对虾养殖系统提供理论支持。     

环境因子对水霉菌生物膜形成的影响

【目的】体外构建水霉菌(Saprolegnia)生物膜(Biofilm,BF),研究环境因子对其生物膜形成的影响。【方法】采用改良的微孔板法研究静置培养条件下寄生水霉(Saprolegnia parasitica)ATCC200013在96孔酶标板上的成膜情况,CCK-8法(Cell Counting Kit-8)定量检测生物膜中水霉菌的活力。【结果】水霉菌的生物膜的OD450值在培养24 h达到峰值,48 h后趋于稳定。随着初始孢子浓度升高,水霉菌生物膜OD450值升高,差异显著(P0.05)。20-25°C生物膜形成量最多,OD450值显著高于其他温度组(P0.05)。在起始pH值为4-11的沙氏葡萄糖液体培养基中,水霉菌均能形成生物膜。在培养基中加入0.12 mmol/L以上CaCl2,能促进生物膜形成;添加0.03-2.00 mmol/L MgCl2,水霉菌生物膜形成量与未添加MgCl2对照组无显著性差异;Cu2+对水霉菌生物膜的形成有显著影响,0.5 mmol/L以上添加处理几乎不形成生物膜;NaCl能明显抑制水霉菌生物膜的形成,当NaCl质量分数低于0.12%时,对生物膜形成的影响较小(P0.05)。水霉菌在鲫皮和肌肉提取液包被后生物膜形成量与对照组相比无显著性差异,而鲫表皮黏液、鳃黏液包被后生物膜的形成量明显减少。【结论】研究首次采用微孔板法体外构建水霉菌生物膜,发现其生物膜的形成与多种环境因素有着密切的关系。这为了解水霉菌生物膜的形成规律提供了一定参考,为水霉菌生物膜的进一步研究奠定了基础。