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1.
刘秀霞  高雄  白仲虎 《微生物学通报》2016,43(10):2261-2268
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物,其基因组中包含编码RNA聚合酶的7种sigma(σ)因子基因,除σA外,其余6种属于选择性σ因子。通过σ因子进行基因表达调控是细菌调控网络中的重要组成部分,因此研究σ因子的功能和调控机制将有助于完善谷氨酸棒杆菌基因调控网络,进而有利于工业生产中菌种优化策略的制定。本文主要对谷氨酸棒杆菌中6种选择性σ因子的功能和调控机制做一综述,并且讨论了在研究选择性σ因子调控功能中需要注意的实验设计问题。最后探讨了选择性σ因子在实际应用中的价值及未来需要深入研究的方向,以期能够为谷氨酸棒杆菌调控网络的进一步完善以及选择性σ因子研究的规范化提供一些参考。  相似文献   
2.
【目的】构建谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体,筛选能够启动蛋白表达的序列片段。【方法】基于谷氨酸棒杆菌表达载体p XMJ19,利用Golden Gate新型克隆方法构建表达元件插入位点,使筛选的片段能够与报告基因快速无缝衔接,同时避免残留额外的序列对表达元件效果测试产生可能存在的干扰。对本课题组前期的谷氨酸棒杆菌BZH001高、中、低溶氧条件下的发酵样品转录组数据进行分析,筛选出稳定于高转录水平的6个基因,通过软件预测每个基因的启动子区域和5′UTR区域,两者构成能够启动基因表达的功能性元件,并将其从基因组中克隆出来。以增强型绿色荧光蛋白基因egfp作为报告基因,快速测量出表达元件的效果。【结果】获得5个不同效果的内源性表达元件,最好的元件插入探测载体后在谷氨酸棒杆菌中表达的荧光强度大于3 500 RFU/OD600。【结论】通过结合转录组数据,探测载体能够快速有效筛选表达元件,为将来人们对谷氨酸棒杆菌基因工程改造和生物系统的构建提供更多基础材料。  相似文献   
3.
由于各种疾病在全球范围内的肆虐,国际市场对重组腺病毒载体(adenoviral vector,Adv)疫苗的需求量急剧增加,而工艺研究是解决这一问题的有效手段之一。在细胞接毒前施加高渗胁迫可以提高分批培养模式下的Adv产量,新兴的灌流培养也可以显著提高Adv的产量。将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合,有望进一步提升高细胞密度生产过程中的Adv产量。本研究利用摇瓶结合拟灌流培养作为生物反应器灌流培养的缩小模型,使用渗透压为300–405 mOsm的培养基研究了高渗胁迫对细胞生长和Adv生产的影响。结果显示,在细胞生长阶段使用370 mOsm的高渗透压培养基,在病毒生产阶段使用300 mOsm的等渗透压培养基的灌流培养工艺有效地提高了Adv的产量。进一步研究发现这可能归因于病毒复制后期HSP70蛋白的表达量增加。将这种工艺放大至生物反应器中,Adv的产量达到3.2×1010 IFU/mL,是传统灌流培养工艺的3倍。本研究首次将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合的策略应用于HEK 293细胞生产Adv,同时揭示了高渗胁迫工艺增产Adv的可能原因,为HEK 293细胞生产其他类型Adv的工艺优化提供了借鉴。  相似文献   
4.
SUMO蛋白酶(Ulp1)是切割小分子泛素修饰(SUMO)融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术,合成基因ulp1(Leu403-Lys621),并在N端和C端加入多聚组氨酸标签(His_6),构建重组表达载体psv T7-ulp1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trx B(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主,转接后7h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为16h,最终蛋白质表达量占菌体总蛋白质量的34.5%,重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L,通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应,测定酶活为5.19U/μl,比酶活为5.23×10~4U/mg,是先前报道比酶活的1.87倍,通过酶活动力学分析,Ulp1的表观米氏常数K_m=0.359g/L,V_m=5.10μg/(ml·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)的表达,得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白,使用表达的Ulp1进行酶切并纯化,获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单,显著改善了scFv在大肠杆菌中难以高效可溶性表达纯化的现状。  相似文献   
5.
通过PULL-DOWN找到与巴斯德毕赤酵母转录激活因子Mxr1相互作用的小分子酪氨酸磷酸酶Ptp,并验证其去磷酸化功能,可以使磷酸化的Mxr1第215位丝氨酸的磷酸基团水解。用Mxr1第215位特定位点磷酸化抗体Western blot检测Mxr1S215在不同培养基中磷酸化情况。发现野生菌株中Mxr1在甘油培养基没有磷酸化,在甲醇培养基发生磷酸化。在Ptp高表达菌株中,无论在甘油还是甲醇培养基Mxr1都没有发生磷酸化,而在Ptp敲除菌株中磷酸化明显高于野生型菌株,说明Ptp调控Mxr1磷酸化。在大肠杆菌中表达并纯化,测定了Ptp酶学性质。构建了巴斯德毕赤酵母Mxr1S215A突变株,发现多个与甲醇代谢相关的基因在转录水平发生变化,推测其可能受S215位点磷酸化Mxr1的调控。  相似文献   
6.
以来自于谷氨酸棒杆菌内源AH6启动子和5′UTR及其前38 bp结合合适的Shine-Dalgarno (SD)序列,构建双顺反子表达载体对木聚糖酶进行表达。为了能够实现分泌表达,选取了来自谷氨酸棒杆菌的两种分泌途径的信号肽,分别为Tat型的CgR0949及Sec型的CspB信号肽。在实现分泌表达之后,对其进行5 L发酵罐的扩大培养以提高分泌量。并对纯化的木聚糖酶进行了部分酶学性质的研究,包括最适催化pH及酸碱耐受性;最适催化温度及热稳定性。结果表明:在上述表达体系中,以CgR0949为信号肽木聚糖酶不能分泌到胞外;木聚糖酶能在CspB信号肽的引导下分泌到胞外,分泌表达量为486.2 U/mL。木聚糖酶的分泌量在5 L发酵罐水平上达到1 648.7 U/mL,是摇瓶培养的3.4倍。该木聚糖酶的最适反应pH为4.5,最适温度为45℃;在pH 4–11范围内4℃处理24 h酶活保持在80%以上;在50℃前处理15 min酶活保持在95%以上,超过60℃则酶活迅速下降至20%及其以下。上述结果表明,谷氨酸棒杆菌内源元件能有效用于木聚糖酶的分泌表达,扩大培养能进一步提升木聚糖酶的分泌量。该双顺反子表达体系能为外源蛋白在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达提供一种可用的工具。此外,通过酶学性质的研究可进一步提高木聚糖酶的催化效率。  相似文献   
7.
目的: 表达可溶性fms样酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)重组蛋白,建立针对sFlt-1的化学发光检测方法。方法: 构建pcDNA3.4-sFlt-1-His*6表达载体,转染至HEK293细胞进行重组表达。利用链霉亲和素-生物素亲和体系及双抗体夹心法,实现对sFlt-1的定量检测。结果: 该方法的最低检测限为2 pg/mL,线性范围为20~40 000 pg/mL,平均回收率为92%,批内及批间精密度变异系数(variable coefficient,CV)均小于10%,与珀金埃尔默sFlt-1检测试剂盒进行比对的相关系数R2为0.925 2。结论: 获得了具有天然生物活性的sFlt-1蛋白,建立了具有良好性能的sFlt-1检测方法,后续进一步开发可应用于子痫前期的诊断筛查。  相似文献   
8.
采用N端截短方式对嗜酸普鲁兰芽孢杆菌Bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶进行分子精简,构建不同形式的N端截短突变体,考察截短突变对表达水平、酶学特性及实用性能的影响。研究结果表明:缺失X45后,目标蛋白几乎全部以不溶形式的包涵体形式存在;缺失CBM41可引起可溶性表达量的大幅提升。缺失CBM41(M1)、X25(M3)、亦或两结构域同时缺失(M5)的变体最适温度(60℃)和最适p H(5.0)与野生型相同。突变体M1和M5的Km值分别提高至野生型的2.4倍和3.1倍,kcat/Km测定结果显示M5催化效率下降明显。突变体M1、M3和M5对分子量较大底物的水解效率略有下降,但对小分子底物的水解效率影响不明显。野生型及突变体M1、M3和M5与糖化酶复配使用时,糖化值(DE)分别为93.6%、94.7%、94.5%和93.1%。上述结果表明,切除CBM41和/或X25结构域的普鲁兰酶变体不影响其在淀粉糖化过程中的应用,且由于分子量减小更易于异源表达,截短突变体可能更适合于工业化生产。  相似文献   
9.
【背景】巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)是一种甲基营养型酵母,近年来作为生产重组蛋白和构建生物合成途径的细胞工厂受到广泛关注。实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)是巴斯德毕赤酵母表达系统研究中一种快速、高效的基因表达水平检测技术,但需要进行归一化处理才能保证所得结果的可靠性。【目的】筛选并验证巴斯德毕赤酵母在不同生长阶段最稳定的内参基因用于精准归一化RT-qPCR的结果。【方法】通过转录组数据分析初步筛选出16个候选内参基因(rps8brpl35arpl10eif5arpl19apor1rpl23b0887tif1ole1rpl14bgssunsdh2trx1ccp1)。通过RT-qPCR技术得到候选内参基因的Ct值,利用qBASE软件中的geNorm程序综合NormFinder算法评估内参基因的表达稳定性。【结果】通过geNorm分析得出精准归一化所需的最佳内参基因个数为2,最稳定的基因是rpl19atif1,NormFinder分析得到稳定性最高的内参基因为tif1。此外,利用甲酸脱氢酶编码基因fdh和乙醇脱氢酶甲醛脱氢酶双功能酶的编码基因afdh对候选内参基因进行验证。【结论】巴斯德毕赤酵母不同生长阶段的RT-qPCR进行精准归一化需要tif1rpl19a这2个内参基因,为相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据,补充了RT-qPCR分析中的内参基因,为巴斯德毕赤酵母不同生长阶段的基因表达调控及其应用研究提供了新的参考。  相似文献   
10.
不同溶氧对谷氨酸棒杆菌代谢的影响   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】以谷氨酸棒杆菌为研究对象,分别控制在0、30%、50%3种溶氧水平下进行发酵,分析不同溶氧水平下代谢的变化。【方法】通过检测发酵代谢物中有机酸、氨基酸的含量,以及测定代谢途径中关键酶活性及其编码基因的表达情况来考察不同溶氧水平下物质代谢发生的变化。通过检测胞内还原力和ATP的含量来分析不同溶氧水平对能量代谢产生的影响。【结果】谷氨酸棒杆菌代谢支路受溶氧的影响而发生改变,氨基酸、有机酸的产量也随之改变。特别是在低溶氧(0)情况下,细胞内氧化磷酸化减弱,导致维持生命活动所必需的ATP供应减少,因此细胞通过增强底物水平磷酸化来产生ATP以满足生命活动的需求。在此情况下,胞内NADH得到较多积累,TCA循环代谢流量减小,而转向糖酵解、乙醛酸循环等,并且这个过程伴随多种杂酸包括乳酸、缬氨酸、亮氨酸等的产生,必将影响目的产物的产量。【结论】研究结果对于进一步采取措施优化溶氧的控制策略,提高目的产物的产量具有指导意义。  相似文献   
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