胱抑素C抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立

制备胱抑素C的单克隆抗体并建立可用于肾损伤早期诊断的化学发光检测方法。合成胱抑素C多肽制备单抗隆抗体,用竞争抑制法筛选优化配对抗体并建立化学发光胱抑素C检测方法。获得胱抑素C单抗细胞共39株,经筛选确定出可配对抗体,通过线性范围、最低检测限、精密性、准确度等分析性能评价,建立了线性范围为50-20 000 ng/mL、最低检测限为3 ng/mL的化学发光胱抑素C检测方法。成功制备胱抑素C配对抗体,并以此为基础建立了化学发光检测方法,为早期肾损伤提供了一种新检测技术和方法。     

血栓调节蛋白化学发光免疫分析检测方法的建立*

目的:建立并评价基于板式化学发光免疫分析(CLIA)平台的血栓调节蛋白(TM)定量检测方法。方法:以链霉亲和素包被微孔板,加入待检血浆,偶联生物素和辣根过氧化物酶的配对抗体组成分析体系,采用双抗体夹心模式,建立TM抗原定量检测方法,并对其进行条件优化和性能评价。结果:生物素化抗体和酶标抗体的工作浓度分别为0.5 μg/mL和0.75 μg/mL,加样后的孵育时间选为15 min,最低检测限为0.2 TU/mL,该检测方法的检测范围为1~200 TU/mL,批间和批内精密度(CV)均小于8%,37 ℃ 10天稳定性良好,207份临床血浆测值与希森美康测值相关性较高(R²>0.96)。结论:建立了TM板式化学发光定量检测方法,且各项性能指标良好,可满足临床检测的需要。     

纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人乙型肝炎表面抗原

目的:应用纳米磁性颗粒标记的免疫层析法,研制可应用于乙肝表面抗原(HBsAg)快速定量检测的层析试纸条。方法:用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联的方法标记纳米磁珠,喷膜仪喷点硝酸纤维膜;根据双抗体夹心法原理建立免疫层析试纸条,对HBsAg特异性抗体捕获的磁信号进行检测,并对磁信号检测结果进行统计学分析和评价。结果:建立了HBsAg纳米磁性免疫层析试纸条,最低限度检测为0.1 ng/mL的HBsAg抗原,检测灵敏度达到了同类产品ELISA分析法的标准,且检测时间控制在5 min内;经检测临床血清标本证实,该方法可根据磁信号定量检测乙肝患者血清中HBsAg的浓度。结论:HBsAg纳米磁性免疫层析方法具有简单快速、灵敏度高的特点,可应用于临床血清样本中HBsAg的检测;该方法为体内极微量抗原抗体的快速检测建立了新模式。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

定量检测 IL-2-HSA 融合蛋白双抗体夹心 ELISA 法的建立

目的:通过抗体配对方法,建立能高特异、高灵敏地定量检测食蟹猴体内 IL-2-HSA 融合蛋白浓度的双抗体夹心 ELISA 法.方法:以 IL-2单克隆抗体为包被抗体、IL-2-HSA 融合蛋白为夹心抗、生物素标记的 HSA 为检测抗体,一抗和二抗的工作浓度分别为8μg/mL 和1∶5000,HRP 标记的亲和素为1∶200.结果:IL-2-HSA 融合蛋白标准品的曲线范围为3.9~250 ng/mL,最低检测限为3.9 ng/mL,与 IL-2、HSA、GLP-1/HSA 和 CD20单抗均无交叉反应,方法的回收率为98.9%~101.5%,批内和批间准确度分别为96.1%~98.3%和93.9%~105.4%.结论:本方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导则的要求,可用 IL-2-HSA 融合蛋白在临床前药代动力学试验的定量检测.     

人IL-35单克隆抗体制备及其在定量ELISA检测方法中的应用

为了建立人白细胞介素-35 (IL-35)的定量ELISA检测方法,RT-PCR克隆了人IL-35的IL-27EBI3亚基和IL-12p35亚基的编码基因,在大肠杆菌中实现了2个亚基的高效表达。以大肠杆菌表达的IL-27EBI3和IL-12p35重组蛋白作为免疫原,免疫BaLb/c小鼠,选取阳性血清小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,用间接ELISA和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选和克隆,获得了稳定分泌抗IL-27EBI3和抗IL-12p35单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在效价测定和特异性鉴定的基础上,进一步筛选出一株能稳定分泌抗IL-27EBI3单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B11和一株能稳定分泌抗IL-12p35单克隆抗体杂交瘤细胞株3A10,亚类鉴定两株单抗均为IgG1。应用单抗3B11和3A10建立了IL-35双抗夹心定量ELISA检测方法,借助生物素-亲和素放大效应,该方法检测IL-35线性范围为3.12–200pg/mL,最低检测限为1.26pg/mL,与多种其他抗原的交叉反应率为0.1%,批内相对标准偏差(RSD)为5.1%–5.6%,批间RSD为5.6%–7.2%,添加回收率为89%–103%,达到定量分析的要求,为进一步组装IL-35定量ELISA检测试剂盒打下了基础。     

33株抗心肌肌钙蛋白T (cTnT) 的单克隆抗体制备、鉴定及应用

旨在制备抗心肌肌钙蛋白T(cTnT)的单克隆抗体(m Ab),对单抗进行初步评价鉴定,并建立(cTnT)的化学发光定量检测试剂。首先利用外购的cTnT抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规m Ab制备技术和间接ELISA法筛选m Ab,以表达和合成的cTnT片段对筛选到的m Ab进行表位鉴定。使用双抗体夹心ELISA方法筛选检测cTnT抗原的配对m Ab,并建立cTnT全自动化学发光定量检测试剂。使用220例临床标本评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性,另外使用238例临床样本和784例体检人群样本评价该试剂的临床应用。我们成功筛选到33株稳定分泌抗cTnT抗体的杂交瘤细胞株,并对单抗的表位进行初步鉴定。我们筛选到能检测10 pg/m L cTnT抗原的配对m Ab E16H8和C8G11,并使用该配对研制出全自动化学发光定量试剂。该试剂与罗氏试剂相关系数r达到0.959 9,检测一致率95%,利用该试剂盒检测临床样本灵敏度为97.5%,特异性为99.15%,99%体检人群的cTnT浓度分布小于0.080 6 ng/m L,符合WHO对急性心肌梗死的定义标准。综上,初步建立了cTnT诊断优势表位单抗,并利用这些优势表位的单抗建立全自动管式化学发光定量检测试剂,与罗氏试剂检测结果符合率高。     

人血清中肺炎链球菌荚膜多糖IgG抗体定量ELISA的初步验证

目的对肺炎链球菌荚膜多糖Ig G抗体定量ELISA,用于人血清中12F、19A、22F及33F型Ig G抗体的检测进行初步验证。方法以不同生产企业相同型别的12F、19A、22F及33F型荚膜多糖为包被抗原,用肺炎链球菌荚膜多糖Ig G抗体定量ELISA,对人血清中12F、19A、22F及33F型Ig G抗体进行定量检测,并对该方法的线性、检测限、检测范围、准确度、精密度、特异性进行初步验证。结果该方法检测13份质控血清的12F、19A、22F及33F型Ig G抗体的范围分别是0.02~4.38 ng/m L、0.14~34.68 ng/m L、0.10~25.20 ng/m L和0.12~29.78 ng/m L,r2均0.99,最低检测限分别为0.35 ng/m L、0.37 ng/m L、0.44 ng/m L和0.88 ng/m L。准确度为71.15%;试验间CV值均20%;特异性均85%。结论肺炎链球菌荚膜多糖Ig G抗体定量ELISA,用于人血清中12F、19A、22F及33F型Ig G抗体的检测,需对准确度、精密度和特异性进一步验证。     

CA19-9时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立

本研究旨在建立一种定量检测血清中CA19-9含量的时间分辨荧光免疫层析检测方法。采用双抗体夹心法与荧光免疫层析技术,以羧基荧光微球和NC膜为载体将CA19-9配对抗体进行标记和包被,制备CA19-9检测试纸条。通过标记、包被抗体量对工艺进行优化,并通过线性范围、最低检出限、精密性等性能指标对CA19-9时间分辨荧光层析检测方法进行评价。最终确定20μL荧光微球的标记抗体量为80μg,检测线包被抗体浓度为1.5 mg/mL时,检测时间为15 min,线性范围为12.5–800 U/mL,最低检出限为6.32 U/mL,批内精密性与批间精密性均小于15%,平均回收率为101%,与罗氏电化学发光检测试剂盒平行检测50份临床样本,两者相关系数为0.980 6。初步建立了定量检测血清中CA19-9的荧光免疫层析检测方法,有较好的临床应用前景。     

一种人抗PD-L1单抗的间接ELISA方法的建立

[目的]制备一种人抗PD-L1抗体,建立其酶联免疫吸附分析(ELISA)的检测方法。[方法]将表达抗体重链和轻链的质粒转染到HEK-293细胞制备抗体,并建立ELISA方法对抗体进行检测。[结果]间接ELISA法的最佳抗原包被浓度为0.25μg/mL,抗PD-L1抗体标准品的起始浓度为0.25μg/mL,最适封闭液浓度为2%BSA,最适封闭时间为2 h,二抗的最佳稀释度为1∶4 000。细胞上清中的抗PD-L1抗体样品1的滴度为125,浓度66.66 ng/mL,灵敏度为6.3 ng/mL;样品2的滴度为125,浓度为81.8 ng/mL,灵敏度为5.9 ng/mL。[结论]建立了一种人抗PD-L1单克隆抗体的间接ELISA检测方法,经对样品1和样品2的批内批间重复性试验统计分析,变异系数均10%,该ELISA法适用于该抗体的检测。     

人心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及定量检测试剂盒的研制

目的：利用抗心肌型脂肪酸结合蛋白单抗,研制定量检测心肌型脂肪酸结合蛋白（ H-FABP ）的ELISA试剂盒。方法使用基因重组H-FABP免疫小鼠,以杂交瘤技术制备特异性抗H-FABP单抗,用这些单抗研制定量检测H-FABP的ELISA 试剂盒。结果筛选获得2株稳定分泌抗H-FABP单抗的杂交瘤细胞株,研制了定量检测H-FABP的ELISA试剂盒,灵敏度达到0．2 ng/mL,线性范围0．4～25 ng/mL,r2＝0．9967,回收率在97．2％～104．5％,精密度的变异系数（CV）≤6．72％;应用此试剂盒检测健康人血浆H-FABP,含量为1．87～8．50 ng/mL。结论所研制的ELISA试剂盒有较好的灵敏度及特异性,可用于人血浆中H-FABP含量的检测。     

B型肉毒毒素单克隆抗体的制备及其检测试剂盒的研制

目的 建立B型肉毒毒素(botulinum toxin B, BoNT/B)快速检测方法,研制B型肉毒毒素酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒。方法 以B型肉毒类毒素为抗原免疫小鼠,用杂交瘤技术获得鼠源单克隆抗体(单抗),体内法扩大制备单抗。间接ELISA测定杂交瘤细胞株分泌单抗的稳定性、腹水效价以及单抗的亚型、理化性质和抗原识别表位。过碘酸钠法对抗原表位差异较大的抗体进行HRP标记,筛选最佳包被抗体和标记抗体,并确定包被抗体包被浓度和标记抗体工作浓度。将其配制成试剂盒,对试剂盒的线性、定量限、准确度和重复性等进行研究。结果 筛选、鉴定8株能稳定分泌B型肉毒毒素特异性单抗的杂交瘤细胞株。8株单抗腹水效价1∶32 000～1∶512 000,重链为IgG类、轻链为κ型,均耐碱、耐热,不耐酸,其中4C11、4D7、7F9和8D2 4株单抗抗原表位差异较大。以4D7为包被抗体、8D2为标记抗体配制试剂盒,B型肉毒毒素滴度在2～32 LD₅₀/mL范围内呈现良好的线性(r=0.996),定量限为0.96 LD₅₀/mL,试剂盒2～8℃有效期为12...     

软骨寡聚基质蛋白荧光免疫层析定量检测方法建立

本研究旨在建立一种可用于类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)辅助诊断的人软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)荧光层析检测方法。采用双抗体夹心法原理制备免疫层析试纸条,并进行性能评价及方法学对比。通过对临床样本的检测得到受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线,计算试纸条灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值。线性范围为0.39–50.00ng/mL;批内批间变异系数均小于15%;试纸条37℃加速破坏20d,荧光信号强度变化范围在15%以内;与类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、抗环瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide,anti-CCP)抗体无交叉反应;与ELISA试剂盒平行检测48份临床血清样本,相关性良好。采用本研究制备的试纸条检测样本,COMP区分RA患者和健康人的cut-off值为22.55 ng/mL (灵敏度为0.821,特异度为0.842,阳性预测值为0.741,阴性预...     

基于GII.4型诺如病毒P蛋白的GII型广谱单克隆抗体制备及应用

人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是全球引起急性胃肠炎的重要传染病原.该病毒遗传多样性丰富,包括了5个基因群以及39种基因型,免疫学检测受限.因此,本研究旨在制备广谱性的HuNoV单克隆抗体,并建立可检测多种基因型的双抗体夹心ELISA方法.本研究通过表达纯化流行毒株GII.4型HuNoVs衣壳蛋白P颗粒免疫Balb/c小鼠,筛选出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体并进行评价.利用辣根过氧化物酶对抗体进行标记及配对筛选,建立了HuNoVs双抗夹心ELISA检测方法,并进行验证.结果 显示:BI0、1D6、1C1细胞株可分泌广谱性单克隆抗体.所建立的双抗夹心ELISA方法酶标抗体最佳工作浓度为1∶5000,捕获抗体最佳包被浓度为2.0μg/mL,该方法检测GII.4型P颗粒最低检出限为125.0ng/mL,对常见HuNoVsGII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.17基因型样本均能检出,而与轮状病毒、星状病毒、肠道病毒、札幌病毒无交叉反应.批间与批内重复变异系数均小于7％.临床样本检测结果显示,本方法与荧光定量RT-PCR结果的符合率为84％.本研究成功制备了广谱性的HuNoVs衣壳蛋白单克隆抗体,建立了可应用于HuNoVs流行毒株基因型的双抗夹心ELISA检测方法,为HuNoVs的诊断及流行病学调查提供了一种简便、特异的免疫学方法.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导人鼻黏膜上皮细胞表达黏蛋白MUC5AC的分子机制

为了观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对诱导人鼻钻膜上皮细胞分泌粘蛋白MUC5AC的影响,并初步探讨其作用机制,本研究首先在体外培养人鼻黏膜上皮细胞株HNEpC,用不同浓度的SEB孵育细胞0~24 h,ELISA检测培养上清中MUC5AC和转化生长因子-α(TGF-α)的含量;实时定量PCR检测MUC5AC mRNA表达水平;Western blot分析表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化。同时采用肿瘤坏死因子转化酶(TALE)siRNA干扰其表达双察其对TGF-α分泌的影响最后采用TGF-α中和抗体、EGFR抑制剂AG-1478或TALE抑制剂TAPI处理细胞,观察其在介导MUC5AC分泌中的作用。结果显示,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL SEB作用鼻黏膜上皮细胞24 h后,可明显诱导其分泌MUC5AC并表达其mRNA,且其分泌水平随着SEB浓度的增高或时间的延长而逐渐增多。SEB也能诱导鼻黏膜上皮细胞分泌TGF-α,并磷酸化EGFR。给予10μmol/L TALE抑制剂TAPI处理细胞后,TGF-α和MUC5AC分泌水平显著减少,采用TALE siRNA干扰其表达后,TGF-α和MUC5AC也得到了类似结果。采用TGF-α中和抗体预孵育细胞30 min后,可明显抑制EGFR磷酸化。此外,TGF-α和EGFR中和抗体以及AG-1478预处理也可降低MUC5AC分泌。以上结果表明SEB经TALE/TGF-α/EGFR诱导人鼻黏膜上皮细胞表达MUC5AC。     

毛细管电泳电化学免疫分析法检测人血清乙肝表面抗原

目的:建立用于测定人血清中乙肝表面抗原的毛细管电泳电化学免疫技术.方法:以微量滴定板为固相载体,预包被上乙肝表面抗体(抗-HBs),与血清乙肝表面抗原(HBsAg)及活化钌标记的乙肝表面抗体之间发生特异性免疫反应,形成三明治结构,将此双抗夹心免疫复合物进行毛细管电泳电化学分析.结果:利用此方法测定人乙肝表面抗原含量,浓度在0.08ng/mL～10 ng/mL范围内与峰电流呈良好的线性关系,线性回归方程为y=0.2840x+0.9535,检出限为0.01 ng/mL(3σ).结论:该法可以实现低浓度乙肝表面抗原血清样本低廉、快速、简便、定量检测.     

建兰花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,3株单抗的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法。蝴蝶兰病叶作1∶10240倍稀释、提纯CymMV病毒浓度为4.87ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.487ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法检测了田间样品,发现CymMV在兰花上发病很普遍。     

一种定量检测人血清高敏C反应蛋白的化学发光免疫方法

旨在建立一种可定量检测人血清高敏CRP的化学发光检测方法 (High-sensitivity C-reactive protein quantifiable chemiluminescent immunoassay,hs-CRP CLIA)。首先利用亲和层析和离子交换层析技术从肝硬化病人腹水中纯化出高纯度的天然CRP作为免疫原制备了22株CRP单克隆抗体 (单抗),其中13株单抗在磷酸胆碱配体捕获ELISA中呈阳性,然后利用方正滴定法筛选出单抗10C5和10C11建立了hs-CRP CLIA。试剂盒评估结果显示：该方法对血清中干扰物质IgG、血红蛋白、甘油三酯等无非特异性反应;该方法检测灵敏度高,在0.04~20.38 mg/L范围内定量检测人血清CRP标准品呈良好线性关系 (R2＞0.993);该方法准确性高、可重复性好,平均回收率为99％,批内差为4.2％~5.8％,批间差为9.0％~11.5％;该方法与进口商品化高敏CRP ELISA试剂盒平行比较检测90份血清标本,结果显示两者有良好的可比性 (r=0.968)。综上,建立的hs-CRP CLIA是一种准确、可靠、可定量的高灵敏C反应蛋白检测方法,该方法的临床应用,有利于改善我国心脏病风险评估及肠炎性疾病预后判断。     

抗HLJ1单克隆抗体的制备及抗原检测方法的建立

为制备抗人肝脏DnaJ-like蛋白(Human liver DnaJ-like protein, HLJ1)的单克隆抗体, 并建立免疫组化和双抗体夹心ELISA检测HLJ1的方法。采用淋巴细胞杂交瘤技术, 获得两株能稳定分泌抗HLJ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株A4C7和 C4C8。经鉴定, 两株单抗的亚类均为IgG1, 并且效价高、特异性好。以单抗A4C7和C4C8作为一抗, 对人胎肝组织石蜡切片进行免疫组化染色, 结果表明, 两株单抗均为阳性染色, 且HLJ1主要定位于胎肝细胞的胞浆。选取A4C7进行HRP酶标记, 并以HRP- A4C7作为酶标抗体, 以C4C8作为包被抗体, 建立双抗体夹心ELISA方法, 并进行棋盘滴定确定抗体的最佳工作浓度。该检测方法的线性范围是15~750 ng/mL, 灵敏度下限达15 ng/mL, 特异性良好。所建立的免疫组化和双抗体夹心ELISA 法可用于快速、灵敏地检测组织及血清中的HLJ1蛋白, 为HLJ1的肿瘤相关性研究提供了有力的工具。     

子痫前期循环系统标志物sFlt-1的重组表达及化学发光检测方法的建立

目的: 表达可溶性fms样酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)重组蛋白,建立针对sFlt-1的化学发光检测方法。方法: 构建pcDNA3.4-sFlt-1-His*6表达载体,转染至HEK293细胞进行重组表达。利用链霉亲和素-生物素亲和体系及双抗体夹心法,实现对sFlt-1的定量检测。结果: 该方法的最低检测限为2 pg/mL,线性范围为20~40 000 pg/mL,平均回收率为92%,批内及批间精密度变异系数(variable coefficient,CV)均小于10%,与珀金埃尔默sFlt-1检测试剂盒进行比对的相关系数R²为0.925 2。结论: 获得了具有天然生物活性的sFlt-1蛋白,建立了具有良好性能的sFlt-1检测方法,后续进一步开发可应用于子痫前期的诊断筛查。