肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统ATP水解酶escN基因突变株的构建

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间嵌合卡那霉素抗性基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46和p CP20介导的重组技术敲除esc N基因,并去除抗性标记;PCR及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的esc N基因,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:构建了Ⅲ型分泌系统缺陷菌株,为进一步研究Ⅲ型分泌系统因子在肠出血性大肠杆菌致病过程中的作用奠定了基础。     

红柄白鹃梅叶中黄酮类物质的提取研究

采用乙醇提取,用分光光度法测定的方法,以红柄白鹃梅为原料,通过正交试验研究了乙醇浓度,提取温度,提取时间和料液比4个因素对提取红柄白鹃梅叶片中总黄酮含量的影响。研究结果表明,各试验因素对红柄白鹃梅叶中黄酮类物质提取量的影响依料液比、提取温度、乙醇浓度、提取时间因素顺次降低,当提取温度为70℃、提取时间为2 h、料液比为1∶20时,提取效果最好,黄酮类物质提取量为22.412 mg/g。     

应用双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中的表达量

为实现人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白 ((GLP-1A2G)2-HSA,简称GGH) 的规模化制备,通过pPICZαB与pPIC9K双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达量。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH的基因片段,构建了表达质粒pPICZαB-ggh,并电转至经载体pPIC9K-ggh异位整合的GGH分泌型菌株——毕赤酵母GS115/F2;然后采用免疫学方法并结合高浓度抗生素筛选获得高产菌GS115/F3,在30 ℃,3％甲醇诱导80 h后GGH的表达量达到了491 m     

一种改良的BrdU免疫组织化学染色抗原热修复技术

目的：探索一种简单有效的行BrdU免疫组织化学染色抗原热修复的方法。方法：本实验探索了三种抗原热修复方法：1）漂片煮沸法,2）贴片煮沸法,3）贴片改良法。将贴有冰冻组织切片的玻片置于恒温封闭体系中进行热修复。之后行BrdU免疫组化染色,栗集图像对这三种热修复方法进行比较。针对贴片改良法行BrdU与NeuN、P。CERB和DCX的荧光双标,采集图像以观察该方法在免疫荧光甄标实验中应用的可行性。结果：1）漂片煮沸法脑组织切片在经过热修复处理后,切片卷起皱缩,不能进行后续实验步骤;2）贴片煮沸法可见少量BrdU阳性细胞,但背景深,且少数脑片起泡,假阳性现象严重;3）贴片改良法B-U免疫组化及与NeuN、P-CERB和DCX的免疫荧光双标染色背景浅,阳性细胞明显。结论：采用改良的热修复法能充分暴露BrdU抗原,DAB显色及免疫荧光染色结果理想。此方法为一种较好的行BrdU免疫组织化学染色抗原热修复方法。     

人骨形成蛋白-7成熟肽基因在巴斯德毕氏酵母中的分泌表达

目的:利用甲醇酵母表达系统,构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽的基因工程菌,并实现其分泌表达。方法:采用PCR方法,依据GenBank数据库中hBMP-7成熟肽序列(AccessionNo.NM_001719)设计并合成一对引物,从已构建的含hBMP-7的克隆载体中扩增获得人骨形成蛋白-7成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,电转化巴斯德毕氏酵母SMD1168,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,经筛选获得rhBMP-7成熟肽表达株,并进行了表达产物的活性测定。结果:表达产物存在于培养上清中,约占分泌蛋白总量的8%。经Western印迹分析可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性。结论:构建了重组人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程菌并在甲醇酵母中实现了分泌表达,为进一步的活性及功能研究奠定了基础。     

光质对东北次生林生态系统主要树种种子萌发的影响

以东北次生林生态系统5个主要树种（日本落叶松、黄檗、色木槭、水曲柳和红松）种子为对象,采取室内控制(5个主要树种)和野外模拟(红松和日本落叶松)相结合的方法,研究光质对种子萌发的影响.室内和实际林分下分别设置了4种不同光质类型处理（以黑暗为对照）和3个红光/远红光比值(R/FR)梯度.结果表明： 不同光质类型除对日本落叶松种子萌发的影响不显著外,对其他4个树种种子萌发影响均显著.其中,黄檗种子萌发率在白光下达到最高,色木槭、水曲柳和红松种子萌发率在红光-远红光-红光照射下达到最高.林分内试验结果与室内一致,红松种子萌发率随林内R/FR下降而明显下降,落叶松种子萌发则不受光质的影响.在自然林分条件下,R/FR随着光斑活动不断变化,色木槭、水曲柳和红松种子萌发格局可能是对森林光斑环境适应的结果.大粒种子萌发显著受光质的影响.     

全反式维甲酸体外诱导P19细胞向心肌方向分化

目的探讨不同浓度全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导P19细胞向心肌分化的效力。方法细胞分成P19细胞组,2nm/L atRA诱导组,5nm/L atRA诱导组,8nm/L atRA诱导组。各组细胞经过诱导、聚集培养、聚集体贴壁培养10天后,RT-PCR检测GATA-4,α-肌球蛋白重链(α-myosin heavychain,α-MHC)的mRNA表达,免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT蛋白共表达,Western blot检测cTnT的蛋白表达。结果 atRA可诱导聚集P19细胞表达GA-TA-4、a-MHC mRNA;α-sarcomeric actin和cTnT的表达和共表达增加;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组GATA-4、a-MHCmRNA的表达量显著高于P19细胞组;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组两种蛋白的表达和共表达量显著高于P19细胞组,以5nm/L atRA组最高,显著高于其它组。结论 atRA可诱导聚集P19细胞向心肌分化,其中5nm/L atRA组效果最好。     

葡萄果粒表皮酵母菌多样性研究

从新疆、甘肃、陕西、宁夏、山东主要酿酒葡萄产区收集葡萄果粒并分离得到酵母258株,利用26S rDNA的D1/D2区序列分析并结合形态学、生理学特征对这些菌株进行了分类学研究,探讨了这些地区葡萄果粒表皮酵母的物种多样性及其分布.共鉴定出13属26种,其中优势属为汉逊酵母属Hanseniaspora(5种),假丝酵母属Candida(4种),毕赤酵母属Pichia(4种)和伊萨酵母属Issatchenkia(2种).对分离自不同地域的同种内不同菌株进行了D1/D2序列分析比较,以探讨不同地理起源地酵母种内序列稳定性及其变异.     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

模拟氮沉降和降雨变化对贝加尔针茅草原土壤细菌群落结构的影响

研究氮沉降和降雨变化对土壤细菌群落结构的影响,对未来预测多个气候变化因子对草地生态系统影响的交互作用具有重要意义。以施氮和灌溉分别模拟氮沉降和降雨增加,采用高通量测序技术,研究8个氮添加水平(0、15、30、50、100、150、200、300kg N hm-2a-1)和2个水分添加水平(不灌溉、模拟夏季增雨100 mm灌溉)对土壤细菌群落结构的影响。结果表明,氮素和水分输入增加后,土壤细菌群落组成、丰度均显著变化(P0.05)。在群落中占主导的细菌门类有疣微菌门Verrucomicrobia(30.61%—48.51%)、变形菌门Proteobacteria(21.37%—29.97%)、酸杆菌门Acidobacteria(9.54%—20.67%)和拟杆菌门Bacteroidetes(4.96%—9.74%)。在常规降雨和水分添加两种条件下,随着氮添加水平的增加,占主导的细菌门类(相对丰度1%)表现出不同的变化趋势。疣微菌门相对丰度在常规降雨N100—N300条件下显著降低,但在氮素和水分同时添加条件下随氮添加水平升高而逐渐升高,在N200—N300时显著升高。变形菌门和拟杆菌门相对丰度在常规降雨高氮添加条件下呈升高趋势,但在水分添加时却无明显变化。酸杆菌门相对丰度在常规降雨高氮添加条件下升高,但在水分添加后呈明显下降趋势。放线菌门Actinobacteria相对丰度在常规降雨N100—N300条件下显著升高,但在水分添加后高氮添加时显著降低。厚壁菌门Firmicutes相对丰度在常规降雨条件下无显著变化,但在水分和高氮添加条件下降低。浮霉菌门Planctomycetes相对丰度在两种不同的水分添加条件下均呈先升高后降低的趋势。氮素和水分添加对土壤细菌群落结构的变化存在明显的互作效应(P0.0001)。在不同氮素和水分输入条件下共有19个土壤细菌门类相对丰度有显著差异。土壤细菌群落结构的变化主要来自于疣微菌门和酸杆菌门的相对丰度变化,两者可作为土壤细菌群落结构变化的指示种。综上,氮素和水分添加显著改变了土壤细菌群落结构,氮素和水分对土壤细菌不同门类相对丰度变化存在明显的互作效应。