毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响

目的:重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-GGH表达的人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白[(GLP-1 A2G)2-HSA,GGH]的细胞活性测评结果显示生物活性较低,这可能与其表达过程中蛋白降解有一定关联.通过对毕赤酵母GS115 STE13基因的敲除,获得一株完整表达蛋白GGH的毕赤酵母宿主,并进一步提高其表达产物GGH的生物活性.方法:采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因,得到一株STE13缺陷型菌株GS115/D13,并通过细胞活性测评系统检测GS115/D13表达产物GGH的生物活性.结果:通过对STE13基因缺陷型菌株GS115/D13与出发菌株GS115/W发酵表达对比,显示GS115/D13菌株表达融合蛋白GGH生物活性有明显提升,且表达量提高了25.8％,两菌株生长无明显差异.结论:STE13基因的敲除成功缓解了GGH表达过程中的降解问题,并相对出发菌株GS115/W大幅度提高了蛋白生物活性.     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据质粒pPIC9K中信号肽基因和质粒pPIC3.5K/hTα1-RP,构建表达质粒pPIC9K/S-hTα1-RP,通过电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达。     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

目的通过构建毕赤酵母表达载体将香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中进行表达,同时对表达产物进行鉴定。方法从香菇菌C91-3菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3＇-Full RACE、5＇-Full RACE方法获得24414基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K中,构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414。用电转化的方法将此质粒转化到毕赤酵母GS115中并进行诱导表达,对表达产物用Westen-blot方法进行鉴定。结果通过菌落PCR和基因序列分析确定插入pPIC9K中的片段为24414基因片段,通过Westen-blot方法确定所表达蛋白为目的蛋白。结论重组质粒pPIC9K-24414成功构建,目的凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功表达,为进一步研究香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414的生物学功能奠定了基础。     

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的表达和分离纯化

将乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因整合到质粒pPIC9K上,构建重组表达载体pPIC9K-coALDH2,用电转导将表达质粒pPIC9K-coALDH2转化至毕赤酵母GS115中,在毕赤酵母中表达经密码子改造的ALDH2。结果表明：重组基因工程菌GS115（pPIC9K-coALDH2）发酵液中蛋白质量浓度为8.40 mg/L,1 mL发酵液中酶活为11.35 mU。     

α-2b干扰素重组质粒的建立及在毕赤酵母中的表达

目的:采用基因工程手段构建基因工程菌表达α-2b干扰素。方法:根据毕赤酵母密码子嗜好性原理设计并合成α-2b干扰素基因序列,将其插入到毕赤酵母Pichia pastoris的分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组分泌表达质粒pPIC9K-IFNα-2b,并用电转化法转化P.pastoris GS115。筛选出整合型His Muts菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,经5d诱导表达后SDS-PAGE检测。结果:菌落PCR和序列测定结果显示重组表达质粒已成功构建,SDS-PAGE结果显示目的蛋白已成功表达。结论:在毕赤酵母中成功表达α-2b干扰素。     

鸡碳酸酐酶4基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过毕赤酵母的表达获得鸡碳酸酐酶4(CAⅣ)蛋白。[方法]根据鸡CAⅣ的序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性,合成CAⅣ基因。将CAⅣ基因克隆到pPICZαA真核表达载体,获得重组表达质粒pPICZαA-CAⅣ。将其电转毕赤酵母GS115后,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-CAⅣ。用终浓度为1%的甲醇对重组阳性菌进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Westernblot法检测蛋白的表达,并用Ni离子亲和层析法对表达出的蛋白进行纯化。[结果]成功构建了表达载体pPICZαA-CAⅣ,转化重组酵母菌后可分泌出36kDa左右的CAⅣ蛋白,并通过Ni离子亲和层析法获得了单一性的目的蛋白CAⅣ。[结论]获得分子量约36kDa的鸡CAⅣ蛋白。     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株.方法根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达栽体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut 转化子.PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达.结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子.结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用.     

猪IL-18在毕赤酵母中的表达及活性分析

采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中扩增出IL-18基因并构建真核融合表达载体pPIC9K-IL-18,电激法转化入毕赤酵母GS115,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,甲醇诱导表达,应用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,并将表达蛋白用凝胶层析柱纯化后,用MTT法检测其生物学活性。实验结果表明重组的GS115酵母菌株可表达分泌pIL-18,其表达在72h时达高峰,分泌量可达160mg/L,纯化的重组pIL-18蛋白具有显著的促进淋巴细胞增殖的活性,说明本试验已在毕赤酵母中在国内首次成功表达了具有生物学活性的pIL-18。     

牛流行热病毒糖蛋白G1抗原表位在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,亚克隆进表达载体pPIC9K,构建重组载体pPIC9K-G1,线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418压力和PCR法筛选阳性重组酵母进行诱导表达。经SDS-PAGE、脱糖基化分析、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析,表明该基因在GS115中表达并进行了适度的糖基化,表达蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA诊断试剂盒。     

庚型肝炎病毒E2区cDNA在毕赤酵母中的表达及抗原性鉴定

从含有庚型肝炎病毒(GBVC/HGV)包膜蛋白E2 cDNA(559bp)的质粒pGEX\|E2中,扩增得到能够编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(GST)和GBVC/HGV包膜蛋白E2的融合基因片段。将此长度为1324bp的DNA片段插入到酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α因子信号肽下游,且与之同框。通过电激转化将构建的重组表达质粒pPIC9K\|GST\|E2插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中。筛选His\++Mut\+s表型的转化子,震荡培养,用05%甲醇诱导表达5d后,在培养液中得到表达的GSTE2融合蛋白。经过表达条件的优化,GSTE2蛋白可占培养液中总蛋白的50%。通过谷胱甘肽亲和层析柱纯化,GSTE2融合蛋白的纯度可达95%左右。以庚型肝炎病人血清为探针,进行免疫印迹及ELISA实验,结果表明该融合蛋白具有能被庚型肝炎病人血清特异性识别的抗原性。     

米根霉糖化酶、类芽孢杆菌木聚糖酶融合蛋白的真核分泌表达

以米根霉(Rhizopus oryzae)3.866基因组DNA为模板,克隆得到糖化酶基因(glucoamylase gene, amyA),基因全长2 049 bp,编码604个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出基因木聚糖酶基因(xylanase A gene, xynA)的成熟肽编码序列,长636 bp,编码211个氨基酸。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌AX11。在AX11发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(5.8 U/mL)和木聚糖酶活性(32.3 U/mL)。     

极细链格孢菌peaT1基因在毕赤酵母中的表达与功能 分析

建立了在毕赤酵母(Pichiapastoris)中分泌表达PeaT1蛋白的技术。将来源于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的基因peaT1亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建了重组表达载体pPIC9K-peaT1,分别用SalI或BglII酶切线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株中,经MD平板筛选、PCR鉴定获得整合有外源基因的重组菌株。在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,PeaT1在酵母中大量表达并分泌到胞外,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的表观分子量约为35kD。表达蛋白上清稀释液能诱导烟草产生对TMV的抗性,其枯斑数抑制率可达到30.37%。每升表达上清液经超滤浓缩和离子交换层析可纯化目的蛋白16.13mg,该纯化蛋白能显著地促进小麦幼苗的生长。     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

猪囊尾蚴磷蛋白在毕赤酵母中的表达及初步应用

将猪囊虫磷蛋白P2基因克隆到毕赤酵母表达系统分泌性表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-P2。经测序证明基因序列完全正确,从而大量制备重组质粒pPIC9K-P2,并用SalⅠ、BglⅡ 两种内切酶分别线性化,然后分别电转化毕赤酵母菌种GS115,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株,利用MM和MD培养基鉴定重组菌株Mut表型,然后用甲醇进行诱导表达;并对表达产物通过SDS-PAGE、Westernblot和ELISA分析,结果表明,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小为12.6kD,表达量占分泌总蛋白的33%,且具有免疫反应活性的重组磷蛋白,从而解决了囊虫病诊断抗原来源问题并为研制新型猪囊虫疫苗奠定了基础。