一个东亚钳蝎蝎毒素BmTXKβ基因的克隆及其基因表达调控

从东亚钳蝎 (ButhusmartensiiKarsch ,BmK)毒腺组织cDNA文库中分离的长链钾通道毒素BmTXKβcDNA序列 ,克隆了BmTXKβ基因组序列 .BmTXKβ基因含有一个长度为 886bp的内含子 ,定位于BmTXKβ成熟肽中 ,与其它蝎毒素基因内含子定位于信号肽的基因结构不同 .并且 ,BmTXKβ基因的内含子特征也与其它蝎毒素基因不同 .研究结果从基因水平上证实了BmTXKβ是一个新的蝎毒素样肽 .以BmTXKβcDNA序列为探针与蝎基因组DNASouthern杂交出现 2条特异性杂交带 .杂交结果为蝎毒素基因可能通过DNA重排、多拷贝或多基因家族来调控基因表达提供了证据 .     

绵羊钙调蛋白调节基因Calponin h1 的分子克隆

在一项研究中我们发现雌激素体在胚胎发育后期对绵羊子宫平滑肌Calponin (CaP) 基因的活动有明显上调作用,而CaP一直被作为观察其他基因表达水平变化的基准参照基因（Reference Gene）。迄今为止, 绵羊CaP尚未完整克隆,为进一步了解其结构和功能,根据人、小鼠和家猪的同源保守区序列设计锚定寡核苷酸引物,通过5′-RACE及3′-RACE方法克隆了绵羊子宫平滑肌组织全长CaP h1 cDNA (GenBank登录号： AY327118), 在cDNA序列的基础上, 又通过PCR-SSP方法获得了CaP h1基因除内含子1、2之外的其余4个内含子全部序列 （GenBank登录号分别为：AY771807,AY771808, AY771809, AY771810） 。DNA序列测定和分析表明,绵羊子宫平滑肌CaP h1 cDNA全长1499bp, 编码297个氨基酸,5′-UTR及3′-UTR分别为79bp和529bp。CaP h1基因组DNA的克隆和序列分析表明,绵羊CaP全长约8kb,由 7个外显子和6个内含子组成。 同源序列比较发现,该基因外显子在不同物种间相对保守;与人类、野猪、小鼠、大鼠和鸡Calponin mRNA同源性分别为88％、92％、81％、79％和81％,但不同物种间内含子存在较大差异(>50%)。本研究填补了绵羊CaP基因分子克隆的空白,为进一步研究该基因的功能及子宫平滑肌收缩的调节机理奠定了基础。     

水稻minE基因的克隆及分析

 植物叶绿体与原核生物分裂机制相似,其中MinE蛋白在细菌分裂过程中具有重要作用. 为了研究植物MinE蛋白在叶绿体分裂过程中的功能及其进化,利用RT PCR技术克隆了水稻叶绿体分裂相关基因OsMinE,并在GenBank登录（No. AY496951）.OsMinE基因cDNA全长1 035 bp,其ORF为711 bp,编码236个氨基酸.与原核生物MinE蛋白相比,水稻OsMinE具有明显延伸的N端与C端.其N端102个氨基酸残基为预测的叶绿体导肽序列,C端延伸保守,推测赋予植物MinE蛋白新的功能.植物minE基因结构分析显示,水稻、拟南芥、杨树都仅含有1个内含子,且插入位置及相位相同.这表明,该内含子可能在单子叶、双子叶植物分化前产生.水稻OsMinE基因在大肠杆菌细胞中的表达严重影响了细胞的分裂,初步证明了水稻MinE蛋白与原核细胞MinE蛋白功能类似.水稻OsMinE基因的克隆为进一步研究叶绿体的分裂机制奠定了基础.     

鳜鱼胰蛋白酶和淀粉酶与胃蛋白酶原基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法,克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)肝胰脏胰蛋白酶(trypsin, Try)、淀粉酶(amylase, Amy)基因 cDNA全序列.结果表明,鳜鱼Try基因cDNA全长为896 bp,其中开放阅读框 (open reading frame,ORF)为744 bp,编码247个氨基酸. 序列同源性分析发现,鳜鱼Try与 斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、 小鼠Try和人TRY氨基酸序列同源性分别为81.4%、75.3%、74.5%和71.4%.鳜鱼Amy 基因cDNA全长为1 647 bp,其中ORF为1 539 bp,编码512个氨基酸.鳜鱼Amy与斑马鱼 、非洲爪蟾、小鼠Amy和人AMY氨基酸序列同源性分别为79.7%、75.4%、71.9%和70.9%. 同时对鳜鱼基因组进行PCR,获得鳜鱼Try、Amy与胃蛋白酶原(pepsinogen, Pep)全基因组DNA序列.序列分析表明,鳜鱼Try基因由4个内含子和5个外显子组成,全长1 362 bp;鳜鱼Amy基因由8个内含子和9个外显子组成,全长4 267 bp;鳜鱼Pep基因由8个内含子和9个外显子组成,全长 4 032 bp,与其它脊椎动物基因结构相似.应用Genome walker方法在鳜鱼克隆得到长度分别为1 189 bp、413 bp和527 bp的Try、Amy和Pep基因的5′侧翼区序列以及1段长为704 bp的Pep 基因3′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个可调节其表达的调控元件.鳜鱼Try、Am y和Pep基因组全序列的克隆及其序列、结构分析和分子系统进化等的研究,为鱼类消化代谢相关基因的生理功能及表达调控机理进一步研究提供依据.     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH1)基因组DNA的分子克隆和序列分析

运用反向PCR (IPCR)技术首次克隆得到全长为 3 50 6bp的中华绒螯蟹 (Eriocheirjaponicasinensis)蜕皮抑制激素 1(MIH 1)基因组DNA序列 (GenBank检索号 :AY3 10 3 13 )。该序列包括 3个外显子、 2个内含子、 412bp的 5′端上游调控区和 917bp的 3′端UTR。编码区的第 1个内含子将信号肽分开 ,第 2个内含子将成熟肽分开。MIH 1基因的外显子和内含子接头区符合受体拼接点和供体拼接点的GT AG法则。MIH 1基因412bp的 5′端侧翼区含有和其它真核基因相似的启动子元件 ,即包括与其它节肢动物高度相似的起始子、TATA盒以及cAMP效应元件结合蛋白的结合位点序列。中华绒螯蟹MIH 1基因的组织方式与斑纹和食用黄道蟹的MIH基因相同。推导的多肽由 75个氨基酸的成熟肽和 3 5个氨基酸的信号肽组成 ,成熟肽的氨基酸序列和食用黄道蟹、三叶真蟹及美洲黄道蟹的一致性在 64% -65%之间     

东亚钳蝎蝎毒素BmKBT基因组序列的克隆及其分析

东亚钳蝎 (ButhusmartensiiKarsch ,BmK)蝎毒素BmKBT(又名BmKabT)是一个在初级结构上相似于β类哺乳动物毒素和功能接近于α类哺乳动物毒素的Na+ 通道毒素 .基于从毒腺cDNA文库中筛选得到的全长BmKBT前体核苷酸序列设计引物 ,以蝎基因组总DNA为模板进行聚合酶链式反应 (PCR) ,将PCR产物克隆至T载体、测序 .序列分析表明 :在BmKBT信号肽编码区的 3′端的- 4位Gly密码子的第 1位与第 2位碱基中有 1个长 2 2 5nt的内含子 ,插入位点距离该基因的起始密码子 4 6nt ,AT含量为 78 7% ,其内含子可能的剪接分枝位点距离 3′剪接受体位点 4 7nt.内含子的大小及其基因组织结构分析表明 :BmKBT具有与α类哺乳动物毒素类似的基因组织结构 ,进一步说明BmKBT是一个介于α类和β类Na+ 通道毒素之间的中间型蝎毒素 ,可以作为研究蝎毒素分子进化的合适材料     

人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用

构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用     

一种新的蝎毒素BmTXKβ的基因组结构及分析

根据从东亚钳蝎(Buthus Martensii Karsch,BmK)毒腺cDNA文库中筛选得到的长链钾离子通道毒素BmTXKβ基因序列设计引物,采用Vectorette方法克隆其5′及3′侧翼区。结果表明：BmTXKβ在编码信号肽的基因序列中有—大于997bp的内含子,并且其成熟肽中也有一个886bp内含子,而目前已知的其他蝎毒素只在信号肽中有一个内含子或没有内含子。BmTXKβ基因组结构的独特性更进一步证实BmTXKβ是一个新的长链钾离子通道毒素成员。     

一株新的胡萝卜软腐欧文氏菌的分离和鉴定

从大白菜软腐组织中分离出一株软腐病细菌BC1,经过形态观察、生理生化特性分析、致病性检测和16S rDNA序列分析,该分离物被鉴定为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora subsp. carotovora, Ecc）的一个新菌株,编号为BC1。这是首次从16S rDNA序列水平上对在我国分布的软腐欧文氏菌进行鉴定。Ecc BC1的16S rDNA序列与其它软腐欧文氏菌株的16S rDNA序列之间同源性达987%～993%,而且在系统发育树中独立于Ecc其它菌株。序列分析结果表明,Ecc BC1具有至少2种不同的16S rDNA序列,它们都在第459位和473位（相对于大肠杆菌16S rDNA序列）发生碱基突变,同一基因中两个突变位点之间彼此互补,处于16S rRNA螺旋H17颈部,而且这两处碱基变异只存在于BC1菌株中。通过与其它软腐欧文氏菌亚种和菌株16S rDNA序列进行比对分析,还进一步鉴定出一些BC1菌株特异的16S rDNA碱基突变位点。本文报道的Ecc BC1两个16S rDNA序列在GenBank中的登录号分别为AY309068和AY309069。     

斜纹夜蛾两个天蚕素D基因的克隆及序列分析

天蚕素是昆虫抵御病菌入侵的一类抗菌肽家族。根据斜纹夜蛾Spodoptera litura天蚕素B基因设计特异引物,通过PCR扩增得到2个新的天蚕素基因部分序列,分别命名为cecD1和cecD2（GenBank登录号分别为EF555567和EF555568）。2个基因编码同一个天蚕素D蛋白,该蛋白的成熟肽与天蚕素B存在2个氨基酸残基差异。序列分析发现cecD1和cecD2中分别包含568 bp和377 bp的内含子序列,它们有相同的5′和3′拼接位点,A+T含量分别为59.7%和69.8%,符合大多数真核生物内含子高A+T含量的特征。     

西伯利亚蓼多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼茎抑制消减文库(SSH)中获得的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting proteins,PGIP) 的EST序列,采用RACE技术在西伯利亚蓼消减库(SSH)成功克隆了PGIP蛋白基因的cDNA序列．该基因开放读码框为1 020 bp,编码339个氨基酸, 具有1段24个残基的保守亮氨酸结构域．序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有PGIPs家族共有的典型保守区域,属PGIPs家族基因,命名为PsPGIP,GenBank登录号为ACD01043．荧光定量PCR分析表明,PsPGIP在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎等器官中均有分布．在3% NaHCO₃诱导表达中,该基因在叶中表达明显受盐胁迫的诱导．推测该基因在抵御盐胁迫伤害中起到了重要的作用．     

一个新的东亚钳蝎毒素(BmKT_1)全长cDNA的克隆和分析

首先构建了东亚钳蝎毒腺组织 c DNA文库 ;根据已知的东亚钳蝎哺乳动物毒素氨基酸序列保守区设计引物 ,并用 PCR从 c DNA文库中扩增出一个 c DNA片段作为筛选 c DNA文库的探针 ;从 c DNA文库中筛选到二个编码同一个新的蝎毒素多肽的 c DNA,它们除 3′- UTR外 ,其余序列完全一致 .它们均含有 2 55bp长的开放阅读框 ,编码 85肽的前体毒素 ,包括 1 9个氨基酸残基的信号肽 ,66个残基的成熟毒素 (命名为 Bm KT1) ;Bm KT1氨基酸序列与已知的蝎毒素具有较大的同源性 ,与 Bm KM1,Lqq ,Lqhα IT和 Bm K M10 的同源性分别为 77%、67%、67%和 65% .Bm KT1的 C端不存在末端修饰步骤且具有一个与这些毒素不相同的特征结构 ,即在末端延伸了两个氨基酸残基 - P- S,推测 Bm KT1具有新的活性功能特征 .     

基于ITS 序列探讨沙棘属植物的系统发育关系

对分布于青海境内的中国沙棘、肋果沙棘和西藏沙棘的ITS区进行扩增和序列分析,并以胡颓子科胡颓子属沙枣为外类群,对胡颓子科沙棘属15种植物的ITS序列进行聚类分析, 探讨沙棘属各植物的亲缘关系.结果表明： 3种沙棘属植物的ITS区长度为600～605 bp,其中,ITS-1区为201～203 bp,5.8S为166～167 bp,ITS-2区为232～236 bp.核苷酸分析显示,3种沙棘属植物的ITS区存在丰富的变异位点.聚类分析表明,棱果沙棘种的2个亚种——棱果沙棘和理塘沙棘为2个不同种,江孜沙棘与柳叶沙棘之间的亲缘关系较近,而与中国沙棘亲缘关系较远;沙棘种下9个亚种间的聚类结果与形态学分类差异较大.
     

Adaptive evolution after gene duplication in alpha-KT x 14 subfamily from Buthus martensii Karsch

A series of isoforms of alpha-KT x 14 (short chain potassium channel scorpion toxins) were isolated from the venom of Buthus martensii Karsch by RACE and screening cDNA library methods. These isoforms adding BmKK1--3 and BmSKTx1--2 together shared high homology (more than 97%) with each other. The result of genomic sequence analysis showed that a length 79 bp intron is inserted Ala codes between the first and the second base at the 17th amino acid of signal peptide. The introns of these isoforms also share high homology with those of BmKK2 and BmSKT x 1 reported previously. Sequence analysis of many clones of cDNA and genomic DNA showed that a species population or individual polymorphism of alpha-KT x 14 genes took place in scorpion Buthus martensii Karsch and accelerated evolution played an important role in the forming process of alpha-KT x 14 scorpion toxins subfamily. The result of southern hybridization indicated that alpha-KT x 14 toxin genes existed in scorpion chromosome with multicopies. All findings maybe provided an important evidence for an extensive evolutionary process of the scorpion "pharmacological factory": at the early course of evolution, the ancestor toxic gene duplicated into a series of multicopy genes integrated at the different chromosome; at the late course of evolution, subsequent functional divergence of duplicate genes was generated by mutations, deletions and insertion.     

西伯利亚蓼铜伴侣蛋白基因在盐胁迫条件下的表达分析

铜伴侣蛋白是细胞质中负责传递铜离子的一种小分子转运蛋白,在逆境胁迫过程中铜伴侣蛋白的ATX1家族具有消除活性氧的作用．本研究应用RACE技术从西伯利亚蓼中克隆了具有完整编码区的铜伴侣蛋白全长cDNA序列,命名为PsATX-1．PsATX-1基因全长516 bp,其中开放读码框为228 bp,编码75个氨基酸,5′非编码区为83 bp,3′非编码区为204 bp．GenBank中登录号为EU620702．经比对发现,该基因所编码蛋白拥有重金属结合位点MXCXXC,缺少多数高等植物铜伴侣蛋白(CCH)所特有的C末端结构域（CTD）．实时荧光定量PCR分析显示,PsATX-1基因在西伯利亚蓼的地下茎、茎、叶中皆有表达,其中叶中表达量最高;PsATX-1基因受3% NaHCO3胁迫诱导,在不同部位表达模式有差异．     

Tremendous intron length differences of the BmKBT and a novel BmKBT-like peptide genes provide a mechanical basis for the rapid or constitutive expression of the peptides

The cDNA sequence encoding a novel BmKBT-like peptide (referred to as BmKBy) was cloned and sequenced from the scorpion Mesobuthus martensii Karsch. Functional analysis indicated that both BmKBT and BmKBy possess strong toxicity in mice, but very weak toxicity in cotton bollworm. Phylogenetic analysis showed that BmKBy and BmKBT represent evolutionary intermediates between the α- and β-toxins from scorpions. The genomic sequences of BmKBT and BmKBy were also obtained. It is interesting to see that two genes, which contain an intron of 225 and 1529bp, respectively, exactly code for the BmKBT peptide. One gene, which contains an intron of 1312bp, codes for BmKBy. Given that genes with long introns favor constitutive expression, whereas those with short introns are rapidly regulated in response to stimulations, the BmKBT_a and BmKBT_b genes provide a mechanical basis for either constitutive expression or rapid generation of the toxic peptides in response to different signals.     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.