一种简单的哺乳动物细胞附着体质粒CaCl2转化方法

目的:建立一种简单经济的哺乳动物细胞附着体质粒还原实验方法。方法:构建附着体载体,转染中国卵巢仓鼠(CHO)细胞和小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a,利用改良的赫特裂解法提取附着体质粒,CaCl2法转化附着质粒至宿主菌大肠杆菌DH5α,再次从DH5α中提取质粒,将转染前后质粒用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切和BamHⅠ单酶切,并将转染前后的质粒进行DNA测序分析。结果:与最初转染的质粒相比,还原质粒双酶切和单酶切后的条带大小一致;DNA测序分析表明,转染前后质粒中的插入序列相同。结论:建立了可用于质粒还原实验的简单的CaCl2转化方法。     

大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化

目的:简化操作流程,缩短提取时间,降低试验对操作者的危害。方法:该方法去除酚、氯仿等有害试剂,采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA);工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除,而且可使质粒的拷贝数进一步增加,提高质粒DNA产量的目的。结果:实验改进方法所提取的质粒DNA产量高于常规方法,达到20μg/mL。结论:改进方法提取的质粒DNA,其下游的内切酶消化,PCR、重组质粒鉴定、转化大肠杆菌等实验的结果和重复性都令人满意,完全可用于一般的分子生物学研究。     

质粒DNA的酚-氯仿一步抽提法

本文介绍了一种极快速提取质粒DNA的方法。该法是对Serghini等发表的方法的改进,全过程只需用酚-氯仿混合液抽提一次,用时少,操作简便,适用于大规模筛选重组克隆子,也可直接用作转化、酶切及DNA序列测定。     

用酚-氯仿直接从克隆中提取质粒DNA

目的:对用酚-氯仿直接从克隆中提取质粒DNA的方法进行了研究。方法:采用不同次数的酚-氯仿抽提,在不同RNaseA作用温度及作用时间下提取了三种质粒。结果:用酚-氯仿抽提2次,RNase A45℃作用8min,质粒纯度(OD260/OD280)为1.85左右、产量大于0.8μg/克隆。结论:本法不但快速,且所提质粒均能满足后续实验如酶切鉴定、测序等方面的需要。对于大批量重组克隆的筛选尤为适合。     

一种经济高效的用Silica提取纯化质粒DNA的方法

目的：为了达到批量提取质粒DNA的目的,在多次实验的基础上,建立一种经济、高效的质粒提取方法。方法：以pUC18、pET28b、pCAMBIA1304等3种质粒为材料,分别采用silica法和碱裂解法提取质粒DNA,通过质粒DNA浓度的紫外分光光度法定量测定、电泳分析和HindⅢ酶切鉴定,对两种质粒提取方法的效果进行了比较与评价;对silica法进行了改进和优化,进行大批量重组子的提取和验证。结果：silica法和碱裂解法提取质粒DNA效果相当,都可进行后续实验,但silica法具有经济、高效、无毒的优势。结论：silica法是一种简单、经济、高效的质粒提取方法,可用于批量质粒DNA提取。     

农杆菌质粒DNA提取方法的改良与鉴定

常规的农杆菌质粒DNA提取常采用碱裂解和酚、氯仿提纯方法,得率较低,一般在50ng/μl以下。针对常规碱裂解法的不足,利用含有pCGⅡ双价载体的LBA4404菌株通过增加菌液收集量、改变提取流程中的反应条件等对常规方法进行了改良,去除了酚、氯仿提纯过程,减少了提取过程对人体的伤害,得率一般在0.5-2μg/μl。所提取质粒DNA可直接用于PCR、限制性酶切等分子生物学试验。     

AZI基因被捕获的鉴定实验

目的 确立基因捕获细胞中被捕获的基因名称. 方法 Southern印迹确定合适的限制性内切酶,用质粒拯救（plasmid rescue）获得含有细胞染色体DNA的质粒,测序.结果 本次实验中,被捕获载体整合的基因是AZI基因. 结论质粒拯救方法能确立质粒整合细胞染色体上准确的位置.     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

人Smurf1基因真核表达质粒的构建和表达

[目的]构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该质粒的正确性。将成功构建的质粒Flag-Smurf1转染HEK-293T细胞和Hela细胞,Western Blotting检测Smurf1蛋白的表达情况;转染Mv. 1. Lu细胞,免疫荧光检测Smurf1蛋白在细胞中的亚定位。[结果]成功扩增出Smurf1基因的ORF序列;连入p CMV5中获得了质粒Flag-Smurf1;酶切鉴定得到2. 2 kb大小的片段,测序结果显示连入的是Smurf1基因的c DNA序列正确。Western Blotting结果显示该质粒可在HEK-293T细胞和Hela细胞中表达,表达大小约为80 k Da,符合预期。免疫荧光实验结果显示过表达的Smurf1主要定位在细胞膜上。[结论]成功构建了带Flag标签的人Smurf1基因的真核表达质粒,该质粒可在细胞中顺利表达。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子的克隆与序列分析

用酚氯仿抽提法提取SD大鼠的肝脏基因组DNA,PCR扩增胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）启动子并克隆至pUC118载体。从含IGFBP-1启动子的质粒中酶切分离出IGFBP-1启动子并测序。PCR扩增出420bp的目的DNA片段,与文献报道的IGFBP-1启动子DNA大小一致。经正、反两方向序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank数据库中的IGFBP-1启动子基因序列一致。以上结果表明克隆成功了IGFBP-1启动子基因,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。     

从Staphylococcus simulans消除含有溶葡球菌酶基因质粒的研究

溶葡球菌酶是Staphylococcus simulans分泌的能分解葡萄球菌的酶,它的基因位于一个约40kb的质粒DNA上。为了探索用高拷贝质粒取代原有的质粒的可能性,本文首先进行了从该菌株中消除含有溶葡球菌酶基因质粒的实验研究,获得了相应的“消除”菌株。根据对目的菌株和原始菌株的比较分析,包括细胞蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Western blot分析,质粒DNA的琼脂糖胶电泳、Southern Blot分析,质粒DNA的限制性内切核酸酶酶切分析以及对溶葡球菌酶作用敏感性的分析,都表明该目的菌株确系Staphylococcus simulans的衍生菌株,只是清除了其中含有溶葡球菌酶基因的质粒。在此基础上,本文也进行了转化实验。     

农杆菌质粒DNA提取方法的优化

目的：为了减化操作过程,减少药品对操作人员有直接或间接危害,提高农杆菌质粒DNA的产率和实验结果的稳定性。方法：对常规碱裂解法进行了改动,改进的方法通过加大菌液的收集量,利用LiCl沉淀RNA,简化操作流程和严格反映环境条件,并且在操作过程中去除了酚、氯仿等对人体有害的试剂。结果：提取时间缩短,结果稳定,产率在1．5μg／μL以下。结论：用这种方法提取的质粒可以满足大多数分子生物学常规实验如DNA的酶切、PCR鉴定的要求。     

三种人全血基因组DNA提取方法的比较

目的：比较改良酚一氯仿抽提法、盐析法、试剂盒法从人全血中提取基因组DNA的效果,以期建立一种快速、经济的提取高质量基因组DNA的方法。方法：分别用上述三种方法从人全血中提取基因组DNA,通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链式反应（PCR）、限制性内切酶酶切检测提取的基因组DNA的产量、纯度和质量。结果：改良酚一氯仿抽提法与试剂盒法提取的基因组DNA相比,DNA的产量有统计学差异,DNA的纯度无统计学差异,但试剂盒法提取的基因组DNA有较明显的降解现象：盐析法与改良酚．氯仿抽提法、试剂盒法相比,基因组DNA的产量和纯度都存在统计学差异,并且基因组DNA聚合酶链式反应（PCR）扩增的稳定性也明显劣于另外两种方法;三种方法提取基因组DNA均能进行限制性内切核酸消化。结论：改良酚一氯仿抽据取法是一种经济、快速、高效、稳定提取人全血基因组DNA的方法,适用于批量临床标本处理。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

λ DNA酶切片段与pUC19克隆载体的构建与鉴定

目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。     

含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装及滴度测定

目的：包装含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒并测定其滴度,用于获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的基因治疗研究。方法：从CCR5Deha32突变个体外周血单个核细胞（PBMC）中提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Deha32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm—T载体连接,随后转化EcoliDH5ct,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序;将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6／V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析;用pLP1、pLP2、pLP／VSVG及pLenti-CCR5Delta32等4种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并测定其滴度。结果：克隆出人CCR5Deha32基因,并构建了含该基因的重组慢病毒载体,经293T细胞包装后产生5×10^5TU／mL的重组慢病毒。结论：高滴度含人CCR5Deha32基因重组慢病毒的包装,为进一步的AIDS基因治疗研究奠定了基础。     

平末端DNA随机连接构建重组质粒

目的:拼接DNA片段并克隆。方法:用T4DNA连接酶将DNA片段以平末端随机连接,随后用限制性内切酶切割,琼脂糖电泳分离酶切产物,挑选特定片段纯化回收,与线性化的载体质粒连接,转化大肠杆菌感受态细胞。结果:通过以上步骤,成功拼接了不同DNA片段,构建了含有目的拼接片段的重组质粒。结论:该方法简便、易行、可靠,可作为拼接、克隆DNA的备选方案,在分子生物学研究和基因工程中应用。     

瞬时外向钾通道Kv4.3真核表达载体的构建

[目的]构建Kv4.3真核表达载体,观察其在真核细胞中表达情况。[方法]提取小鼠前额叶皮质RNA,通过RT-PCR和常规PCR技术扩增获得Kv4.3目的基因,利用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶和T4 DNA连接酶将其克隆在pcDNA3.1载体中,并将构建好的重组质粒转染至HEK293细胞中,免疫印迹方法检测Kv4.3蛋白表达。[结果]成功扩增了Kv4.3基因(2 000 bp处有明显条带),先后经酶切和酶连后的重组体转化培养,提取质粒,再通过双酶切观察到2 000 bp处有Kv4.3目的条带和5 400 bp处有pcDNA3.1载体条带。将此重组质粒送去测序,结果显示基因测序结果与GenBank中Kv4.3序列一致。免疫印迹结果发现在HEK293细胞中,转染的重组质粒能够表达Kv4.3蛋白。[结论]成功构建了Kv4.3真核表达载体,其在HEK293细胞中可以稳定表达。     

一种快速简单的质粒DNA纯化方法

本文介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法。本法对煮沸提取法进行改良后,快速提取质粒DNA粗制品,然后用国产滤纸从琼脂糖凝胶中回收纯化质粒DNA。同时对本法所提取的质粒DNA的回收率、浓度、纯度及可能的用途进行验证和讨论,证明此法简易,所得样品纯度高,可直接用于转化、酶切和基因克隆。