黄河鲤性别决定时间和相关基因表达研究

鱼类性别决定和分化机制极为复杂,通过性腺组织切片鉴定得出黄河鲤从未分化性腺发育为Ⅱ期精巢、卵巢的时间为受精后第40天到第80天。选取一些可能参与黄河鲤性别决定分化相关的基因（amh、ar、cyp19a、cyp19b、dax1、dmrt1、er、foxl2、nobox、sox9a、sox9b、zp2）进行实时荧光定量PCR分析各个基因在受精后40d、45d、50d、55d、65d和80d的表达情况。结果显示性别决定相关基因在50d都有高表达,推测45-50 d为性别决定的关键时间。ar、amh、dax1、dmrt1、sox9a、sox9b六个基因在80d雄性表达量升高,且雄性明显高于雌性,推测这些基因参与精巢分化发育过程。cyp19a、cyp19b、foxl2、nobox、zp2五个基因在80d雌性表达升高,且高于雄性,推测其可能参与卵巢分化发育。     

光周期对许氏平鲉性腺分化过程中形态学、性激素水平及相关基因表达的影响

研究以35日龄(dpb)许氏平鲉(Sebastes schlegelii)仔稚鱼为对象, 研究不同光周期(短光照组L﹕D=8﹕16、长光照组L﹕D=16﹕8和对照组L﹕D=12﹕12)对性别分化、相关激素水平及基因表达水平的影响。结果显示非自然的光周期尤其是较短的光照, 会不同程度地影响性腺分化时期性腺发育程度, 并且短光照会导致部分性腺雄性化; 雌激素(E₂)在短光照组中更早出现峰值, 而雄激素(T)在3个处理组中均在实验第9天时达到峰值; 4个卵巢分化相关基因cyp19a1a、ERα、ERβ2和foxl2中, ERα、ERβ2和foxl2受短光照影响显著, 实验中后期出现明显的抑制(P<0.05); 4个精巢发育相关基因sox3、sox9、amh和dmrt1相对表达水平未见明显规律, 可能与精巢分化时间较晚有关。综合而言, 较短的光照会影响性腺的发育以及性腺的分化, 抑制卵巢分化基因的表达, 诱导原始性腺雄性化。     

养殖施氏鲟的性腺转录组特征分析

鲟是目前世界上最古老的软骨硬鳞鱼类之一, 雌雄个体之间无明显的第二性征。为了解人工养殖下鲟性腺发育的分子特征, 研究以人工养殖2龄施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt)为研究对象, 对其精巢与卵巢进行转录组测序分析。结果发现, 雌雄性腺中共有19690个差异表达基因转录本, 其中与性别分化相关基因包括转录因子Dmrt1、Sox9、Foxl2等和生长转化因子Amh、Bmp15、Gdf9等。另外, 通过差异表达基因KEGG代谢通路富集分析发现了4条与卵巢发育相关的通路, 分别为黄体酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、卵巢类固醇合成、促性腺激素释放激素信号通路。其中, 卵巢类固醇合成通路中18个差异表达基因的表达模式暗示了2龄施氏鲟限制卵巢雌激素的合成, 但精巢中雄激素的合成未受影响。研究结果为研究鲟性腺分化和发育机制以及今后在mRNA表达水平上鉴定鲟性别提供了基础。     

棉铃虫雌雄性腺转录组的比较分析

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是我国重要的农业害虫,生殖力强是其发生为害的内在生物学基础,而已知的与棉铃虫生殖相关的基因信息相对较少,本研究旨在筛选棉铃虫性腺发育的相关基因。【方法】通过高通量测序技术对棉铃虫成虫的卵巢和精巢进行转录组测序。【结果】共获得100 603条unigenes,平均长度为666.05 bp,其中N50为1 114 bp。经同源性比对,52 071条unigenes获得注释信息,其中注释到Nr数据库的序列最多。通过比较转录组分析发现,在棉铃虫精巢和卵巢中存在7 714个差异表达的基因（Differentially expressed genes,DEGs）,其中3 288个DEGs表达水平在卵巢中上调,4 426个DEGs在精巢中上调。差异基因富集结果涉及到生殖系统发育的相关通路有mTOR信号通路、卵母细胞减数分裂、促性腺激素释放激素信号通路和胰岛素信号通路等。同时筛选得到部分与性腺发育相关的基因,包括vitellogenin(Vg)、vitellogeninreceptor(Vg R)、chorion-relatedgene、testis-specific serine/threonine-protein kinase和spermatogenesis-associated protein等。选取其中12个DEGs用实时荧光定量检测其表达量,结果表明RT-qPCR与RNA-Seq的结果一致。【结论】本研究获得了棉铃虫雌雄性腺的转录组数据及主要性腺发育相关基因,将有助于丰富棉铃虫繁殖相关的基因资源,为进一步研究棉铃虫生殖调控机理提供基础数据。     

中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.     

Cyp19a1基因在中华鳖早期卵巢分化中的功能研究

芳香化酶是雌激素合成的关键酶,在非哺乳类脊椎动物的早期雌性性腺分化中起重要的调控作用.本研究首先分析了中华鳖(Pelodiscus sinensis)芳香化酶编码基因Cyp19a1在不同组织及不同发育时期雌雄胚胎性腺中的表达情况;其次,利用芳香化酶抑制剂(AI)和慢病毒RNA干扰及过表达技术,进行Cyp19a1基因的功能验证研究.研究结果表明,Cyp19a1基因在中华鳖成体卵巢组织中高度特异性表达,睾丸和心、肝、脾、肺、肾、肌、肠中未见表达.同时发现,Cyp19a1基因在第18期就呈现雌性性腺特异性表达,早于性腺分化启动时间(第19期).功能缺失实验表明,经过AI及Cyp19a1-shRNA处理后,ZW胚胎性腺皮质区退化,髓质区高度发育,形成原始性索结构,呈现雌性向雄性性逆转现象;同时雌性标记基因Foxl2的表达量下调,雄性标记基因Amh的表达量则显著上调.功能获得实验则表明,Cyp19a1过表达后的ZZ型性腺皮质区高度发育,髓质区退化,形成空洞结构,呈典型雌性特征,同时Foxl2基因的表达量上升,Amh的表达量显著降低.综上所述,本文证明了Cyp19a1是中华鳖早期卵巢分化的关键调控因子,为中华鳖性别分化机制研究奠定了基础.     

大口黑鲈amh基因全长cDNA克隆、表达及多克隆抗体制备

为研究大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗缪勒氏管激素(amh)基因的表达及其在性腺发育中的潜在作用,研究利用RACE技术克隆得到了大口黑鲈amh基因,并制备Amh多克隆抗体,通过qRT-PCR、Western Blot分析Amh在大口黑鲈不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式,最后利用HE染色法和免疫组化观察不同发育阶段性腺的形态组织学变化及其与Amh表达的潜在关系。结果显示:大口黑鲈amh基因cDNA序列全长2050 bp,由24 bp5′非编码区、394 bp3′非编码区和1632 bp的开放阅读框组成,共编码543个氨基酸。amh基因mRNA在大口黑鲈11个组织中均有表达,其中雄鱼精巢中表达量最高,肌肉次之,雌鱼卵巢中表达量最高,肌肉次之。amh基因在雌雄鱼不同发育阶段的性腺中表达存在显著差异,精巢中表达量均显著高于卵巢(P<0.05)。同时, Western Blot结果显示Amh蛋白在精巢中表达丰度较高。amh基因在精巢中的表达量呈先上升后下降的趋势,且在孵化后65d鱼精巢中其表达量达到最高(P<0.05),免疫组化结果显示Amh表达于早期精...     

中华鳖Dmrt1基因在雄性性别分化中的功能分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文通过慢病毒-Dmrt1-sh RNA干扰和Dmrt1-OE过表达载体系统的构建,成功实现了Dmrt1基因在中华鳖胚胎发育过程中的高效异常表达,以探讨Dmrt1在中华鳖雄性性别分化中的功能.结果显示,经过Dmrt1-sh RNA干扰处理后的ZZ胚胎,32.0%发育成雌性(生理)个体,而经过Dmrt1-OE过表达处理后,25.5%的ZW胚胎发育成雄性(生理)个体.苏木素/伊红(HE)染色、q PCR和免疫组化分析表明,Dmrt1基因敲低后,ZZ胚胎性腺外形和组织结构明显雌性化,雄性特异性基因Amh和Sox9表达显著降低,雌性特异性基因Cyp19a1和Foxl2表达则显著上升,出现雄向雌的性逆转现象;而Dmrt1过表达后的ZW胚胎性腺则向睾丸分化,Amh和Sox9表达急剧上调,Cyp19a1和Foxl2表达显著下降,呈现雌转雄性逆转现象.上述研究表明,Dmrt1基因在中华鳖早期雄性性别形成过程中是必需的,且它的异位表达能够单独启动雄性分化,是中华鳖雄性性别分化的关键因子.     

家蚕5龄幼虫精巢和卵巢microRNA芯片及转录组比较分析

【目的】本研究旨在通过对家蚕Bombyx mori 5龄幼虫精巢和卵巢组织微小RNA (microRNA, miRNA)基因芯片及转录组进行分析,找到参与家蚕性腺发育相关的miRNA分子及可能的靶基因。【方法】采用新一代高通量测序平台对家蚕5龄幼虫精巢和卵巢(分别定义为Test和Control)进行miRNA基因芯片检测及转录组测序分析,根据P＜0.05且log₂(fold change, FC)≥2的标准,通过比较筛选出Test vs Control的差异表达miRNA;根据q≤0.05且|log₂(fold change)|≥1的标准,通过比较筛选出Test vs Control的差异表达基因 (differentially expressed genes, DEGs);随机选取8个上调和12个下调差异表达miRNA,对其表达及其预测的5个靶基因进行qRT-PCR验证;对DEGs以及差异表达miRNA的靶基因进行KEGG通路富集分析。【结果】从精巢和卵巢样本中(Test vs Control)分别鉴定出68个差异表达miRNA和3 991个DEGs,其中上调和下调miRNA分别为36和32个,上调和下调DEGs分别为2 033和1 958个。差异表达miRNA的qRT PCR验证结果均与芯片数据一致。KEGG通路富集分析结果显示DEGs在新陈代谢及核糖体的信号通路显著富集。对差异表达miRNA在DEGs中的可能靶基因进行预测,结果找到了4组表达趋势相反的miRNA与靶基因：分别是bmo-miR-2774a与LOC101745556;bmo-miR-92b与LOC101735954以及bmo-miR-3266与LOC733130和LOC778467;1组表达趋势一致的miRNA与靶基因：bmo-miR-3321与LOC101744895。5个靶基因的qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。【结论】本研究获得了家蚕5龄幼虫精巢和卵巢转录组及miRNA芯片数据,筛选并验证了4组差异表达和1组一致表达miRNA及潜在靶基因,为探究家蚕精巢和卵巢发育差异奠定了基础。     

Sox8基因过表达诱导中华鳖ZW性腺的雄性分化

为了研究Sox8基因在中华鳖性别分化中的功能,研究利用慢病毒介导的过表达载体,在性别分化前的雌性中华鳖中过表达Sox8。通过组织学分析和生殖细胞标记蛋白VASA的免疫荧光染色发现在Sox8过表达后,50%的ZW性腺髓质区发育出睾丸特有的、含有生殖细胞的性索结构; qRT-PCR和免疫荧光结果显示雌性特异性基因Foxl2和Cyp19a1表达量显著降低,而调控睾丸发育的Dmrt1、Sox9和Amh基因表达上调。实验结果表明Sox8的过表达诱导ZW胚胎性腺往雄性方向分化,揭示了Sox8在中华鳖睾丸分化过程中的作用。     

眼优角蚱两性成体转录组差异分析

为了解蚱类昆虫两性间基因转录水平上的整体差异,本研究以眼优角蚱Eucriotettix oculatus为研究对象,通过高通量转录组（RNA-Seq）测序和分析技术对其雌、雄成体的转录组进行了测定和分析。结果显示,在雌、雄转录组中共获得13 432条转录本,两性间差异表达基因共3 597个,其中雌性相对于雄性显著上调基因1 295个,显著下调基因2 302个。对其中9个差异基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与RNA-Seq分析一致。差异基因显著富集的GO条目大多是与细胞的形成有关,结合、细胞组分和细胞过程等条目相关基因显著高表达。KEGG富集显示差异基因主要是与性腺发育、遗传信息加工、能量代谢和消化等通路有关。研究结果对从分子水平进一步研究眼优角蚱两性差异提供一定的理论基础。     

黄体酮对成年斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴相关基因转录表达的干扰效应

黄体酮(P4)是一种类固醇激素。为了探究P4的内分泌干扰效应, 选择成年斑马鱼(Danio rerio)作为受试生物, 研究了P4对斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)相关基因转录表达影响。成年斑马鱼在不同浓度P4(2、11和16 ng•L–1)下处理21 d。结果显示: 暴露于高浓度组的P4能够抑制雌鱼大脑中促性腺激素释放激素2(gnrh2)、促性腺激素释放激素3(gnrh3), 卵泡刺激素(fshb)、雌激素受体1(esr1)基因的转录表达; 然而诱导了雄鱼大脑中fshb、黄体生成素(lhb)、雄激素受体(ar)基因的转录表达, 这些转录变化暗示了P4对成年斑马鱼有潜在的弱雄激素效应。此外, P4暴露对雌鱼卵巢和雄鱼精巢类固醇合成途径中固醇激素合成急性调节蛋白(star)、细胞色素p450介导侧链裂解酶(cyp11a1)、17α羟化酶(cyp17)、卵巢细胞色素P450芳香化酶(cyp19a1a)、11β羟化酶(cyp11b)、羟基类固醇3β脱氢酶(hsd3b)、羟基类固醇20β脱氢酶(hsd20b)、羟基类固醇17β脱氢酶3(hsd17b3)、羟基类固醇11β脱氢酶2(hsd11b2)以及受体信号途径中孕激素受体(pgr)、esr1、ar基因的转录表达没有显著影响。可见, 在P4暴露下, 斑马鱼大脑比性腺更加敏感。总而言之, P4能够改变斑马鱼大脑中HPG轴相关基因的转录表达水平, 进而对斑马鱼的内分泌系统具有潜在的危险。     

胡子鲇Dmrt1基因全长cDNA克隆及其表达分析

以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,利用RT-PCR技术和SMART RACE技术克隆获得Dmrt1基因cDNA全长,并利用生物信息学分析其结构及功能;利用半定量RT-PCR技术检测胡子鲇性腺(精巢/卵巢)、肌肉、肠、肝脏、心脏、头肾、鳃丝、脑和眼等10种组织以及Ⅱ—Ⅴ期精巢中Dmrt1基因表达。结果表明:胡子鲇Dmrt1基因cDNA全长为1417 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)为35 bp,3′非编码区(3′-UTR)为516 bp,开放阅读框(ORF)包含864 bp,编码287个氨基酸(aa),预测所编码DMRT1为主要位于细胞核内的不稳定性亲水蛋白。氨基酸序列比对显示,胡子鲇DMRT1与已公布的非洲胡子鲇、蟾胡子鲇、黄颡鱼等鲇形目鱼类的相似性为83.3%—96.1%。胡子鲇DMRT1中具有DMRT基因家族共有的、保守性很高的DM结构域,此结构域具有典型的"C2H2C4"锌指结构,与上述鲇形目鱼类的相似性达100%,与斑马鱼、青鳉、虹鳟等鱼类的相似性为91.9%—97.3%,而与鸡、鼠、猪人等的相似性达80%以上。组织表达显示,胡子鲇Dmrt1基因仅在精巢中表达,且Ⅱ期精巢(即精子发生期)中Dmrt1基因表达量显著高于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢(P<0.05),而卵巢及其他8种组织中均无表达,表明Dmrt1是胡子鲇精巢特异性表达基因,可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关。