中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.     

三角帆蚌SOX2基因的分子鉴定及表达分析

SOX基因家族是一系列在性别分化、胚胎发育、细胞多功能性的维持等方面具有重要作用的转录因子,在高等脊椎动物中研究比较深入,但在淡水珍珠蚌中却很少见。本研究利用RACE法克隆获得了三角帆蚌SOX2基因的序列,其cDNA全长为1 840 bp,开放阅读框为672 bp,编码氨基酸223个。该基因具有SOX基因家族典型的HMG-box蛋白结构域,与其他物种对比发现,保守性极高。实时荧光定量PCR组织表达结果显示,在斧足中表达量最高,在肝脏中最低,同时发现雌雄性腺之间存在极显著性差异,雌性性腺表达量明显高于雄性性腺;性腺在早期胚胎中表达量明显高于其他时期,推测SOX2基因参与了三角帆蚌的性别分化和胚胎发育过程。     

M、F型ATP8基因在雌雄三角帆蚌不同发育时期的表达差异研究

双壳贝类中有两种线粒体遗传方式,一种通过精子传递线粒体基因组,一种通过卵子传递线粒体基因组。这种现象被称为线粒体基因组的双单亲遗传(doubly uniparental inheritance, DUI)。本实验首先对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii) F、M-type ATP8基因进行了克隆,得到了它们的cDNA全序列。F-type ATP8基因全长275 bp,编码49个氨基酸;M-type ATP8基因全长222 bp,编码58个氨基酸。在此基础上研究了三角帆蚌从胚胎时期到三龄成熟时期时F、M-type ATP8基因的表达差异。胚胎期到8月龄的三角帆蚌性腺部位组织团中,M、F-type ATP8基因在各时期均有表达,同时期对比发现,F-type ATP8基因的表达量明显高于M-type ATP8基因。12月龄雌雄三角帆蚌各组织中,F-type ATP8表达量高于M-type ATP8,处于主导地位。24月龄雌雄三角帆蚌各组织中,M、F-type ATP8均能检测到表达,M-type ATP8仅在性腺中高表达。36月龄雌雄三角帆蚌各组织中,F-type ATP8均能检测到,M-type ATP8表达量都非常低;而在雄性中,仅在性腺中高表达。研究表明,随着三角帆蚌的发育,M-type ATP8仅在雄性性腺中存在,在其他组织中选择性降解。     

鲫Dmrt3基因的克隆和表达分析

DMRT家族是一个与性别决定相关的转录因子家族。为了研究家族成员之一的Dmrt3在我国重要养殖鱼类鲫胚胎发育、性别分化中的功能以及在育种中的作用,我们克隆了鲫Dmrt3基因的cDNA全长,并对Dmrt3基因在发育早期和不同组织中的表达进行了分析。结果显示:鲫Dmrt3基因cDNA全长为2182 bp,其中5￠端非编码区408 bp,3'端非编码区427 bp,开放阅读框1347 bp,编码448个氨基酸。蛋白结构预测显示DMRT3除了正常的DM结构域外,还有DMA结构域,在进化上与DMRT4和DMRT5的亲缘关系更近。巢式RT-PCR分析结果表明Dmrt3直到尾芽期才开始有微量表达,表达量在15体节期有明显增加但仍然处在一个较低的水平;在成体组织中只在精巢中检测到表达。这种表达时空模式提示Dmrt3可能在早期器官发生和雄性性腺发育调控中起作用。对Dmrt3启动子CpG岛的甲基化分析表明所检测的组织和配子中并不发生甲基化,说明这种雌雄特异性和组织特异性差异表达并不是通过对该基因启动子的差异甲基化修饰来调控的。此外,我们还发现了鲫Dmrt3的一个由逆转录产物形成的假基因pDmrt3。这些结果为进一步研究鲫Dmrt3在性别分化中的作用和评估其在鲫性别控制育种中的价值,以及分析DMRT家族的进化关系提供了基础资料。       

三角帆蚌Hc-GSK3β基因鉴定及内壳色性状相关SNP筛选

为了探究三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)糖原合成激酶-3β(GSK3β)基因对壳色的影响,研究采用RACE技术获得Hc-GSK3β基因cDNA全长1867 bp,其中包含1261 bp的ORF区编码420个氨基酸, ORF中含有一个S＿TKc结构域,该结构域序列高度保守。组织差异表达分析发现Hc-GSK3β基因在紫色蚌鳃、斧足、内脏团和边缘膜组织中表达量高于白色蚌的表达量(P<0.05),且在斧足和边缘膜表达差异水平达到极显著(P<0.01),而在紫色蚌闭壳肌组织中表达量显著低于白色蚌(P<0.05)。原位杂交(ISH)实验结果显示在三角帆蚌外套膜的外褶、中褶、內褶、背膜区和腹膜区均有阳性信号产生,且在外褶的信号表达较强烈。该基因经重测序比较,共鉴定出6个SNP位点,其中在C+185A位点的CA基因型在紫色蚌的分布频率显著高于白色三角帆蚌(P<0.05);在紫色蚌中, T+341G位点TT基因型三角帆蚌内壳颜色参数b值显著低于TG基因型(P<0.05)。研究表明, Hc-GSK3β基因参与了三角帆蚌壳色形成,筛选的SNP标记可用于三角帆蚌壳...     

三角帆蚌精氨酸酶基因的cDNA克隆与组织表达分析

精氨酸酶(Arginase,Arg)是生物体尿素循环当中一种标志性的酶类,它不但与生物体许多疾病相关,而且是目前用于治疗肿瘤和癌症的一种重要的工具酶。根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,运用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得三角帆蚌精氨酸酶基因的全长cDNA序列。生物信息学方法分析表明精氨酸酶基因cDNA序列长1720 bp,开放阅读框(651072)1008 bp,编码335个氨基酸,5端非编码区为64 bp,3端非编码区为648 bp,软件推测其编码蛋白相对分子量为36.81 kD。研究采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法分析该基因在不同组织中的表达规律,结果表明,该基因在肝脏、胃、肠、鳃、心脏、外套膜、斧足共7个组织中都有表达,但主要集中在肝脏、胃和肠消化器官中表达。这可能说明低等的无脊椎动物三角帆蚌的精氨酸酶兼具有Ⅰ型和Ⅱ型精氨酸酶的特征和功能,既可以参与尿素循环,又可以在生理和病理过程中发挥重要作用,但还需进一步验证。       

中华鳖Amh基因的克隆、表达及在雄性分化中的功能初探

为了阐明Amh基因在中华鳖雄性性别分化中的调控作用,本研究对Amh基因进行cDNA序列克隆和表达分析,同时通过慢病毒介导的RNA干扰技术对Amh基因进行了功能验证.RACE结果显示,中华鳖Amh基因的cDNA序列全长为3233 bp,5'非翻译区为997 bp,3'非翻译区为834 bp,可读框为1401 bp,编码466个氨基酸.实时荧光定量PCR结果显示,在成体组织中,Amh基因在睾丸中高度特异性表达;在胚胎发育过程中Amh基因在性别分化启动前的第16期便开始呈现雄性特异性表达,并贯穿此后整个发育时期,而在雌性性腺中则维持非常低的表达水平.在芳香化酶抑制剂诱导的雌性向雄性性逆转胚胎性腺中Amh表达显著上升;在雌二醇诱导的雄性向雌性性腺中,Amh表达则显著下降.RNA干扰实验表明,Amh基因敲低后,ZZ(基因型雄性)胚胎性腺外形和组织结构明显雌性化,皮质区发育,而髓质区高度退化,出现雄性转雌性的性逆转现象;同时雄性分化相关基因Sox9表达下调,而雌性分化相关基因Cypl9al表达则急剧上调.上述结果表明,中华鳖Amh是雄性特异性因子,在早期雄性性别分化过程中是必需的关键基因,本研究为中华鳖性别决定机制研究奠定了基础.     

池蝶蚌Sox2 基因在不同组织及不同月龄精巢中的表达

Sox 基因家族在胚胎发育过程和性别分化中起重要作用, 为研究池蝶蚌中Sox 基因的功能, 以人SRY基因HMG-box 保守区的序列设计简并引物, 以雌、雄池蝶蚌基因组DNA 和精巢cDNA 为模板进行扩增, 获得了2 个不完全相同的序列, 分别为DNA-HMG1、DNA-HMG2 和cDNA-HMG, 长度均为220 bp, 编码73个氨基酸。与人等物种Sox1、Sox2、Sox3 及Sox14 有很高的同源性, 雌雄个体之间没有序列差异性。采用RACE-PCR 扩增获得了池蝶蚌性腺Sox2 部分cDNA 片段, 长度为1774 bp, 该序列核苷酸与欧洲帽贝的SoxB和人类的Sox2 的同源性最高; 在部分开放阅读框249 个氨基酸残基中, 具有Sox 家族典型的HMG-box 结构域, 与人类、小鼠、原鸡和斑马鱼等Sox2 的HMG-box 同源性为98%。为了解该基因在各组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR 方法分析了外套膜、闭壳肌、鳃、肠、肝、肾、精巢和卵巢在内的8 种组织hs-Sox2的表达情况, 结果显示, hs-Sox2 基因在8 种组织中均有表达, 其中在肾脏中的表达量最高, 其次是肠与闭壳肌, 在雄性性腺中的表达量明显高于雌性性腺, 在肝脏中的表达量最低; 为了解hs-Sox2 在不同性腺发育时期的表达情况, 采用实时荧光定量PCR 方法分析了5 个不同月龄的精巢组织中hs-Sox2 的表达情况, 结果显示在39 月龄性腺的表达量最高, 其次是16 月龄性腺, 63 月龄蚌中的表达量最少。以上结果表明, hs-Sox2 基因可能参与了池蝶蚌精巢的发育及功能的维持。       

中华鳖Dmrt1基因在雄性性别分化中的功能分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文通过慢病毒-Dmrt1-sh RNA干扰和Dmrt1-OE过表达载体系统的构建,成功实现了Dmrt1基因在中华鳖胚胎发育过程中的高效异常表达,以探讨Dmrt1在中华鳖雄性性别分化中的功能.结果显示,经过Dmrt1-sh RNA干扰处理后的ZZ胚胎,32.0%发育成雌性(生理)个体,而经过Dmrt1-OE过表达处理后,25.5%的ZW胚胎发育成雄性(生理)个体.苏木素/伊红(HE)染色、q PCR和免疫组化分析表明,Dmrt1基因敲低后,ZZ胚胎性腺外形和组织结构明显雌性化,雄性特异性基因Amh和Sox9表达显著降低,雌性特异性基因Cyp19a1和Foxl2表达则显著上升,出现雄向雌的性逆转现象;而Dmrt1过表达后的ZW胚胎性腺则向睾丸分化,Amh和Sox9表达急剧上调,Cyp19a1和Foxl2表达显著下降,呈现雌转雄性逆转现象.上述研究表明,Dmrt1基因在中华鳖早期雄性性别形成过程中是必需的,且它的异位表达能够单独启动雄性分化,是中华鳖雄性性别分化的关键因子.     

翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的克隆及表达研究

采用同源克隆与SMART RACE技术首次分离和克隆了翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的c DNA全长,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术分析了其在翘嘴鳜成体不同组织及性腺不同发育时期的表达特点。序列分析结果显示,CYP19a基因全长1 873 bp(Gen Bank登录号为KX911988),其中开放阅读框长1 581 bp,编码526个氨基酸。通过多序列比对,发现该基因编码的蛋白质具有P450arom A特定的功能保守序列,包括I-螺旋区、Ozol肽区、亚铁血红素结合区域以及芳香化酶特异性结合区域;同时,CYP19a基因序列的同源性分析结果显示,其在脊椎动物中较为保守。此外,q PCR检测结果显示,CYP19a基因在翘嘴鳜成体组织中的表达存在显著差异(P0.05),主要在性腺中表达,其次在脑和肝脏有少量表达;而且CYP19a基因在繁殖期性腺中的表达量显著低于非繁殖期性腺中的表达量(P0.05)。以上研究表明,CYP19a基因在鱼类性腺形成及发育过程中具有重要作用。     

马氏珠母贝Sox11基因的克隆及时序表达模式分析

为探究Sox(SRY-related HMG-box genes)基因家族在马氏珠母贝个体发育及性别分化中的作用, 研究首先利用兼并引物从马氏珠母贝基因组中克隆到一个HMG框(high mobility group box), 利用RACE-PCR技术从SMART cDNA文库中克隆到一个Sox基因的cDNA全长, 通过Clustal X和MEGA 4软件对该序列进行比对分析并构建系统进化树; 通过荧光定量PCR技术对该基因在不同组织及发育不同时期性腺中的表达情况进行分析。结果显示, 马氏珠母贝该Sox基因的cDNA全长为1579 bp, 其中开放阅读框(ORF)为1008 bp, 编码336个氨基酸, 5'非编码区为126 bp, 3'非编码区为445 bp。同源性分析表明, 马氏珠母贝Sox基因与太平洋牡蛎Sox11基因的同源性(Identity)最高, 为80%, 故命名为pmSox11; 系统进化树分析也显示pmSox11与太平洋牡蛎Sox11基因的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析组织表达特异性显示, pmSox11在马氏珠母贝神经节分布较多的组织如外套膜、鳃、足、消化盲囊等大量表达, 在神经节相对较少的闭壳肌和卵巢中表达量较少; 时序表达图谱显示, pmSox11在3月龄幼贝性腺和1年龄发育早期精巢中表达量最高, 在2年龄成熟精巢和2年龄性转换性腺中表达量降低, 而在2年龄卵巢中表达量最低。研究表明, pmSox11基因可能在马氏珠母贝早期神经系统发育和性别发育的调控方面起到重要作用。     

胡子鲇Dmrt1基因全长cDNA克隆及其表达分析

以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,利用RT-PCR技术和SMART RACE技术克隆获得Dmrt1基因cDNA全长,并利用生物信息学分析其结构及功能;利用半定量RT-PCR技术检测胡子鲇性腺(精巢/卵巢)、肌肉、肠、肝脏、心脏、头肾、鳃丝、脑和眼等10种组织以及Ⅱ—Ⅴ期精巢中Dmrt1基因表达。结果表明:胡子鲇Dmrt1基因cDNA全长为1417 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)为35 bp,3′非编码区(3′-UTR)为516 bp,开放阅读框(ORF)包含864 bp,编码287个氨基酸(aa),预测所编码DMRT1为主要位于细胞核内的不稳定性亲水蛋白。氨基酸序列比对显示,胡子鲇DMRT1与已公布的非洲胡子鲇、蟾胡子鲇、黄颡鱼等鲇形目鱼类的相似性为83.3%—96.1%。胡子鲇DMRT1中具有DMRT基因家族共有的、保守性很高的DM结构域,此结构域具有典型的"C2H2C4"锌指结构,与上述鲇形目鱼类的相似性达100%,与斑马鱼、青鳉、虹鳟等鱼类的相似性为91.9%—97.3%,而与鸡、鼠、猪人等的相似性达80%以上。组织表达显示,胡子鲇Dmrt1基因仅在精巢中表达,且Ⅱ期精巢(即精子发生期)中Dmrt1基因表达量显著高于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢(P<0.05),而卵巢及其他8种组织中均无表达,表明Dmrt1是胡子鲇精巢特异性表达基因,可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关。     

池蝶蚌β-连环蛋白基因cDNA的克隆及表达特征分析

为了解淡水贝类性别调控与分化机制, 课题组建立了池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺转录组, 在转录组库中, 存在β-连环蛋白(β-catenin)基因序列。实验对池蝶蚌β-catenin基因进行验证, 采用RACE技术克隆其cDNA全长, 命名为Hsβ-catenin。该序列全长4386 bp, 5′-非编码区为162 bp, 3′-非编码区为1758 bp, 开放阅读框为2466 bp, 编码821个氨基酸; 该蛋白结构域主要由12个ARM重复序列组成; 二级结构中, α-螺旋占47.75%, β-折叠占1.22%, 随机卷曲占51.04%; 三级结构中含大量α-螺旋且为右手超螺旋, 构成ARM结构域; 系统进化树分析表明, Hsβ-catenin与软体动物聚为一支, 然后与昆虫类聚为一支。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测显示, Hsβ-catenin在肠中表达量最高, 其次是斧足和精巢。Hsβ-catenin基因在12月龄和36月龄表达量较高, 且在36月龄表达量最高, 表明其可能参与池蝶蚌的性别调控与分化作用。     

三角帆蚌热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

对三角帆蚌HSP70基因序列进行全长克隆及其分子生物学分析,并检测其在不同水温刺激下鳃组织中的表达变化。通过高通量转录组测序获得三角帆蚌HSP70基因（HcHSP70）长片段,采用3'RACE对其进行了3'末端克隆,经拼接得到HcHSP70 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对HcHSP70 cDNA全长序列进行了特征分析,采用实时荧光定量PCR技术检测了其组织分布,并结合Western-blot技术检测蚌鳃中该基因mRNA与蛋白经不同水温刺激后的表达变化。结果显示,HcHSP70 cDNA全长为2298 bp,其中开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸。预测分子量大小为71.6 Ku,pH7.0时的理论等电点为5.61。氨基酸序列分析表明,HcHSP70氨基酸序列含HSP70家族的3个标签序列（I₉DLGTTYS₁₆、I₁₉₇FDLGGGTFDVSIL₂₁₀和I₃₃₆ VLVGGSTRIPKVQK₃₅₀）,与长牡蛎及泥蚶的HSP70同源性最高（91%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HcHSP70在鳃、性腺、肝胰腺、外套膜及肌肉等5种被检组织中均有表达,以肝胰腺中的表达水平最高。实时荧光定量PCR与Western-blot技术检测皆表明,蚌鳃组织中HcHSP70基因与蛋白的表达量在37℃时达到最高,而在40℃水温刺激下表达水平下调至正常值,表明其在适应高温刺激时发挥了重要作用。     

三角帆蚌钙网蛋白基因cDNA的全长克隆与表达分析

采用同源克隆策略和RACE技术,从三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）外套膜组织中成功克隆得到钙网蛋白（Calreticulin,CRT）基因的全长cDNA序列,共1838 bp,开放阅读框为1257 bp,编码418个氨基酸,5'端非编码区为75 bp,3'端非编码区为506 bp,基因序列提交GenBank的登录号为JX416227。生物信息学分析表明,三角帆蚌钙网蛋白基因具有一段信号肽序列、两条典型的钙网蛋白家族标签序列KHEQNIDCGGGY和IMFGPDICG、三个保守的N-、P-和C-端功能域及内质网前导序列HDEL。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与海洋双壳类紧密聚在一起,且与蚯蚓等环节动物亲缘关系较近,聚为一支,然后依次与虾类、昆虫、鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。经荧光定量PCR检测,钙网蛋白基因在三角帆蚌的外套膜、闭壳肌、斧足、鳃、肝脏、性腺、心脏、肠等8个组织中均有表达,其中在外套膜、鳃和斧足等与贝类钙代谢相关的组织中表达量较高预示其可能参与三角帆蚌的钙代谢。不同Ca2+浓度处理试验的结果表明,随着水体中Ca2+浓度逐渐升高,三角帆蚌钙网蛋白基因在外套膜中的表达水平呈先上升后下降的趋势,并在60 mg/L时达 到最高峰,表明适宜的Ca2+浓度可促进钙网蛋白基因表达,而过高的Ca2+浓度则会抑制其表达。同时在60 mg/L Ca2+浓度条件下,对三角帆蚌外套膜进行不同时间的表达试验,结果表明钙网蛋白基因的表达量随时间推移先上升,并于48h达到最大表达量,而后逐渐下降。上述结果为进一步深入研究钙网蛋白基因的功能及其调控机理奠定基础。