产鼠李糖脂生物表面活性剂大肠杆菌的构建与优化

目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得,从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌,将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhl AB)以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhl AB基因和rha BDAC基因簇(TDP-L-鼠李糖合成的基因簇)进一步利用合成启动子进行组合调控,筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化,鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L,是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵,12h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。     

铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选

从多种来源筛选高产鼠李糖脂的菌株,并研究菌种发酵特性和鼠李糖脂产物的理化性质。采用CTAB平板初步筛选鼠李糖脂合成菌株,通过分析菌株的16S r RNA基因序列确定细菌种属,采用薄层色谱、红外光谱分析产物性质。结果显示,利用CTAB平板初筛获得163株阳性菌株,初步发酵确定10株高产细菌鼠李糖脂的产量为12.2-17.7 g/L,10株细菌均鉴定为铜绿假单胞菌。挑选产量最高的菌株B12,分别以甘油、菜籽油、花生饼粉或葵花籽饼粉为碳源进行发酵,发现菜籽油为合成鼠李糖脂的最佳碳源。进一步对比在35℃、37℃和40℃的发酵水平,发现37℃条件下鼠李糖脂产量最高,为26.8 g/L。最后,对鼠李糖脂发酵产物进行了初步纯化,并进行了薄层色谱和红外光谱分析。菌株B12能够合成较高水平的鼠李糖脂,可能成为工业生产的候选菌株。     

ARTP诱变选育鼠李糖脂高产菌及鼠李糖脂促进枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究

旨在选育鼠李糖脂高产菌株,以实验室筛选的产鼠李糖脂的Pseudomonas aeruginosa C3为出发菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP),选育出一株高产突变株Pseudomonas aeruginosa SC-11,产量比出发菌株提高了74.1%。进一步对产鼠李糖脂的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了优化,优化后的鼠李糖脂产量达42 g/L,底物转化率达到0.7 g/g底物。添加0.01%鼠李糖脂到Bacillus subtilis CL产羧甲基纤维素酶与木聚糖酶的培养基中,羧甲基纤维素酶活与木聚糖酶活分别提高12.9%和18.3%。研究表明,鼠李糖脂通过增加细胞通透性来提高胞外酶产量。     

9株海洋来源铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的比较分析

目的:从海洋来源的铜绿假单胞菌中筛选多株具有鼠李糖脂合成能力的菌株。方法:以9株分离自不同海洋环境的铜绿假单胞菌为研究对象,考察并比较其发酵合成鼠李糖脂生物表面活性剂的表面活性、产量和产物成分的差异,扩增并比对合成途径中的关键基因。结果:9株菌的发酵产物均具有表面活性,其中菌株1A01151发酵液的表面活性最强,表面张力值可降低至28 m N/m;9株菌的基因组中均含有鼠李糖脂合成途径中关键基因rhl AB和rhl C,都具有合成单、双鼠李糖脂的能力;菌株1A01151和1A00364的发酵产量最高(2.69 g/L),产物经LC-MS/MS检测,所合成的鼠李糖脂同系物组分不同,双糖双脂的含量最高(1A01151:75.96%;1A00364:61.01%)。结论:海洋来源的铜绿假单胞菌是具有鼠李糖脂高产潜力的菌株,可用于合成性能不同、组成多样的鼠李糖脂生物表面活性剂。     

预水解发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3产鼠李糖脂特性及应用效能的影响研究

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3(Pseudomonas aeruginosa NY3)产鼠李糖脂(Rhamnolipids,Rha)的特性影响较大。研究了利用废弃动物油作为发酵碳源时,其碱预水解和酶预水解对NY3菌发酵产鼠李糖脂产量、产物结构和性能的影响,从碳源水解酸值与水解产物、鼠李糖脂组分结构和实际应用效果进行了研究。碱、酶预水解实验发现,碳源酸值由初始的19.81 mg/g分别提高到72.04 mg/g和73.75 mg/g,气质联用(GC-MS)分析检测结果表明,碱、酶预水解后,碳源均释放7种C14-C18碳链的脂肪酸,鼠李糖脂产量由未预水解的8.28 g/L分别提高到15.35 g/L和17.63 g/L。液质联用(LCMS-IT-TOF)分析结果表明,用未预水解及碱、酶预水解碳源发酵时,NY3菌所产鼠李糖脂中单糖脂含量分别为62.07%、65.67%、87.32%。利用NY3菌在中试条件下处理高浓度石化企业油污泥,发现鼠李糖脂能促进NY3菌去除油污泥中的石油烃,且促进作用强弱顺序为未预水解产Rha碱预水解产Rha酶预水解产Rha。     

响应曲面法优化铜绿假单胞菌DN1的产鼠李糖脂条件

鼠李糖脂是近年来具有广阔应用前景的生物表面活性剂之一,因应用范围广和环境友好等特点,使其成为潜在的合成表面活性剂的替代品。本研究以一株能产生鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DN1为研究对象,采用Plackett-Burman设计和响应曲面方法(RSM)对其产鼠李糖脂的发酵条件进行优化。Plackett-Burman试验设计表明,磷酸盐、C/N比和p H值对鼠李糖脂的产量具有显著影响。在此基础上,采用RSM对3个显著因素的最佳水平范围进行研究,结果表明当磷酸盐为1.71 g/L、C/N比为15.5、p H值为6.5时,其理论最佳鼠李糖脂产量为40.4 g/L,与实测鼠李糖脂产量39.84 g/L非常接近。摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的22.9 g/L提高了73.97%。     

铜绿假单胞菌中鼠李糖脂生物合成的研究进展*

鼠李糖脂因其具有环境友好和卓越的物理化学特性,而有望成为化学合成表面活性剂的替代物。近年来鼠李糖脂得到了广泛的研究,其目的是利用低价的可再生资源进行大规模生产,但目前的研究成果仍不足以选育出更具商业竞争力的鼠李糖脂过量合成菌株。为此,进一步理解鼠李糖脂生物合成的复杂基因调控网络,探索降低生产成本的发酵工艺势在必行。综述了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂的生物合成途径、群体感应对主要基因的调控、鼠李糖脂在生物膜形成中所发挥的作用,以及发酵优化对鼠李糖脂产量的影响。有助于加深对鼠李糖脂生物合成的认识,为提高鼠李糖脂产量提供重要参考信息。     

铜绿假单胞菌中鼠李糖脂生物合成的研究进展*

鼠李糖脂因其具有环境友好和卓越的物理化学特性,而有望成为化学合成表面活性剂的替代物。近年来鼠李糖脂得到了广泛的研究,其目的是利用低价的可再生资源进行大规模生产,但目前的研究成果仍不足以选育出更具商业竞争力的鼠李糖脂过量合成菌株。为此,进一步理解鼠李糖脂生物合成的复杂基因调控网络,探索降低生产成本的发酵工艺势在必行。综述了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂的生物合成途径、群体感应对主要基因的调控、鼠李糖脂在生物膜形成中所发挥的作用,以及发酵优化对鼠李糖脂产量的影响。有助于加深对鼠李糖脂生物合成的认识,为提高鼠李糖脂产量提供重要参考信息。     

应用数学统计法优化副干酪乳杆菌HD1.7固定化细胞制备和产细菌素发酵

摘要：【目的】应用数学统计法对副干酪乳杆菌HD1.7的固定细胞制备和发酵条件进行优化,以提高细菌素产量。【方法】用26?2部分因子分析法筛选对细菌素产量影响显著的因子,发现海藻酸钠浓度、接种量和发酵时间对细菌素的产生影响显著。利用最陡爬坡法逼近最大响应区域。用Box-Behnken设计确定最佳海藻酸钠浓度、接种量和发酵时间,并进行分批重复发酵。【结果】固定化生产细菌素的最佳条件是海藻酸钠浓度2.8%、CaCl2浓度5%、固定化时间4 h、菌体包埋量1/20、发酵时间63 h和固定化细胞的接种量8.2%,在此基础上用固定化细胞进行分批重复发酵,每批细菌素的发酵周期为24 h,产量为游离发酵的70%,比游离细胞发酵周期缩短1/2。【结论】通过对固定化细胞制备和发酵条件的优化,固定化细胞在327 h的分批重复发酵中细菌素的总体产量比游离细胞提高了19%,发酵液中无明显细胞渗漏现象且实现了细胞的重复利用,为细菌素的进一步研究和最终提取奠定了基础。     

鼠李糖脂对微生物降解石油烃废水的影响

目的:研究鼠李糖脂对微生物降解石油烃废水的影响.方法:通过测定生物量和观察菌株表面来研究鼠李糖脂对菌株的影响;通过正交实验设计,确定石油烃降解率影响因素.通过石油烃降解率的测定,探讨鼠李糖脂与H2O2深度氧化协同作用对微生物降解石油烃的影响.结果:菌株对石油烃的降解率达53%,在相同条件下,添加鼠李糖脂的石油烃降解率提高了12%-20%.添加鼠李糖脂后菌株的生物量明显增多,菌株细胞表面疏水.正交设计表明,影响石油烃降解的主导因子是培养温度,其次是培养时间和鼠李糖脂的添加量.正交设计得到最佳组合为A3B2C1,即培养时间为7d;温度为35℃,鼠李糖脂浓度为60mg/L.3个因素的最佳组合下,石油烃降解率为82%.加入200 mg/L的H2O2时,降解率从82%提高到97%.结论:鼠李糖脂能促进菌株的生长.鼠李糖脂与H2O2深度氧化协同作用有助于微生物对石油烃类污染物降解效率的提高.     

甘薯叶柄原生质体有效植株再生

将甘薯(Ipomoea batatas (L．)Lam．)‘元气’和‘白星’(‘White Star’)的叶柄原生质体培养在含有0.05 mg·L-1 2,4-D和0.5 mg·L-1 KT的改良MS液体培养基中,3～4 d后细胞开始分裂。培养8～9周后,将直径达1～2 mm的愈伤组织转移到添加0.05～0.2 mg· L-1 2,4-D和0～0.5 mg·L-1 KT或添加0.5～2.0 mg ·L-1 NAA和1.0～3.0 mg·L-1 BAP 的MS固体增殖培养基上使其增殖。转移3～5周后,将愈伤组织再转移到MS基本培养基或转移到添加2.0～3.0 mg·L-1 BAP的MS培养基上。当进一步转移到MS基本培养基上后,从愈伤组织或从愈伤组织形成的不定根上再生出植株。‘元气’植株再生率高达60.0 ％,White Star高达43.4％。     

多花兰种子无菌萌发及离体快繁研究

以多花兰种子为材料,研究了无机盐浓度、植物生长调节剂和光照条件对多花兰种子非共生萌发的影响,在此基础上,通过研究原球茎增殖和分化、芽苗壮苗和生根的培养基配方及培养条件,建立多花兰组培快繁技术体系.结果表明:多花兰种子萌发培养基为1/6 MS十NAA0.5 mg·L-1+6-BA 2.0 mg· L-1+马铃薯泥50g·L-1+AC 1.0g·L-1,光照度为1.25μmol·m-2·s-1,萌发率63.6％;原球茎增殖继代培养基为1/4 MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg· L1+AC 1 g·L-1+PE 200 g·L-1,繁殖倍数6.5倍/60 d,芽分化率60.2％;再生芽分化培养基为1/4 MS十6-BA2.0mg·L-1+NAA 0.2 mg· L-1+AC 1 g·L-1+PE 200g· L-1,繁殖倍数4.0倍/60 d,芽分化率85.0％;芽苗壮苗和生根培养基为1/6 MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+AC 1 g·L-1+蔗糖20g·L-1 +PE 200 g·L-1和1/4 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA1.2 mg·L-1+AC1 g·L-1十蔗糖20g·L-1+PE200g· L-1,生根率达100％,生根苗移栽成活率90％.此技术可用于多花兰种苗繁育和种质资源保护.     

诺丽叶片的离体再生

以诺丽(Morinda citrifolia)叶片为外植体,在添加不同激素种类和浓度的MS培养基上进行离体培养,建立两种离体再生模式:模式Ⅰ为先脱分化愈伤组织,再分化不定根和不定芽;模式Ⅱ为直接培养生根后分化不定芽。结果表明:在模式Ⅰ中,诱导诺丽叶片产生愈伤组织的最优培养基为MS+0.1 mg·L~(-1)6-BA+2.0mg·L~(-1)2,4-D;诱导叶片愈伤组织再分化出不定根和不定芽的最优培养基为MS+1.0 mg·L~(-1)6-BA+0.4 mg·L~(-1) NAA或MS+2.0 mg·L~(-1)6-BA+0.4 mg·L~(-1) NAA,其中MS+1.0 mg·L~(-1)6-BA+0.4 mg·L~(-1) NAA生根时间最早为10 d左右,根系较发达,而MS+2.0 mg·L~(-1)6-BA+0.4 mg·L~(-1) NAA生根时间在15 d左右,根系发达。在模式Ⅱ中,诱导叶片直接生根长芽的培养基为MS+1.0 mg·L~(-1)6-BA+0.4 mg·L~(-1) NAA。将模式Ⅰ和模式Ⅱ中,完成诺丽叶片离体再生的苗切下后接种到MS+0.2 mg·L~(-1) NAA培养基中诱导生根,15 d左右分化出不定根,45 d获得完整植株。该研究结果为后续的遗传转化和基因改良研究奠定了基础。     

梭梭(Haloxylon ammodendron)组织培养和快繁技术

为了优化梭梭分化苗生根的培养基配方和培养条件,以剪去幼根的梭梭无菌苗茎、叶部分作为外植体,通过芽生芽途径获得了梭梭再生苗,重点对生根培养基和培养条件进行了系统的研究,根据试验结果得出结论:梭梭腋芽诱导培养基为MS+6-BA 2 mg.L-1,壮苗培养基为MS+6-BA 1.5 mg.L-1+GA3 1.0 mg.L-1,生根培养基为1/4MS+5%蔗糖+IBA0.2 mg.L-1+NAA 0.8 mg.L-1,生根率为74%。     

珍稀濒危植物香果树胚性细胞悬浮系的建立和植株再生

以香果树(Emmenopterys henryi)未成熟种子为试材, 探讨不同的接种量、基本培养基、糖浓度及植物生长调节物质等对体细胞胚胎生长的影响, 建立稳定的香果树胚性细胞悬浮培养与植株再生体系。结果表明: 悬浮培养条件下, 最适接种量为2%(鲜重); 较适合的基本培养基为MS; 蔗糖浓度为1%时容易使球形胚聚合体愈伤化, 浓度为3%和6%适合球形胚聚合体增殖, 浓度为9%则容易使球形胚聚合体褐化; 添加0.5 mg.L-16-BA 和0.5 mg.L-1 NAA的MS液体培养基, 当初始蔗糖浓度为3%, 然后逐步提高到6%则有利于香果树各个发育阶段的同步化; 子叶胚转到不含任何植物生长调节物质的MS固体培养基中可以长成正常植株。     

茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其没食子酸含量的测定

通过愈伤组织诱导途径, 建立了快速高效的茶条槭再生体系。成熟种子在MS+1.0 mg·L-1 6-BA的培养基中萌发, 以茎段作为外植体, 在WPM+0.002-0.01 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA中培养3周诱导形成愈伤组织, 诱导频率平均为98.0%。愈伤组织转入WPM+0.01 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 6-BA培养基中得到再生芽, 分化频率为42.0%,平均每块愈伤产生再生芽10个左右。转到WPM+0.3 mg·L-1 IBA的培养基上的再生芽均可生根并长成完整植株, 小苗移栽成活率达到89.0%。实验还建立了愈伤组织中没食子酸的提取和HPLC检测方法。对深绿色愈伤组织连续培养2个继代后, 没食子酸含量达到2.8%。     

一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统

以成熟胚愈伤组织为材料的农杆菌介导水稻转化法虽已建立, 但转化频率仍有待提高。本文以粳稻(Oryz a sativa)品种(中花10号和中花11号)的成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料, 对组织培养体系及影响遗传转化的因素进行优化, 建立了一套改进的农杆菌介导的水稻高效遗传转化系统。农杆菌菌株为EHA105, 质粒载体是pUN1301/ OsRAA1, 其中含有标记基因GUS 和筛选基因HPT。愈伤组织诱导培养基为NBD2 (NB+2 mg·L-12,4-D), 继代培养基为NBD0.5, 预分化与分化培养基为RE1 (MS+1 mg·L-16-BA + 0.25 mg·L-1 NAA + 0.5 mg·L-1 KT + 0.2 mg·L-1 ZT)和RE2 (MS+ 1 mg·L-1 6-BA + 0.5 mg·L-1 NAA+ 0.5 mg·L-1 KT + 0.2 mg·L-1 ZT)。另外, 还分析了影响T-DNA转移的多种因素, 如外植体种类、愈伤组织预培养基和愈伤组织继代次数等。采用优化的转化程序, 水稻愈伤组织转化率和植株转化率可达70%以上。     

白花天目地黄的愈伤组织再生体系研究

白花天目地黄是天目地黄的一个优良变型,其资源稀少。本研究以白花天目地黄幼嫩叶片为外植体,探讨不同生长调节物质对其愈伤组织诱导及植株再生的影响。结果表明:MS+BA1.5mg·L-1+IBA0.5mg·L-1是诱导叶片愈伤组织最佳的培养基;MS+BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1培养基对不定芽分化的效果最好;不定芽增殖最适宜的培养基为MS+BA2.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1;其不定芽的最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.05mg·L-1;试管苗移栽成活率达到96.7%。同时,在此基础上探讨了白花天目地黄的园林绿化及对地黄属药用方面的利用前景。     

魔芋丛生芽诱导成苗及生根技术研究

采用不同激素配方的1-9号培养基,探索了由魔芋丛生芽诱导试管苗的最佳培养基配方。试验结果表明:MS+6BA1.5 mg.L-1+NAA0.5 mg.L-1+IBA1.0 mg.L-1和MS+NAA1.0 mg.L-1+PP3331.0 mg.L-1两种培养基对于诱导出苗及生根效果最好,添加PP333不仅可加快出苗生根,还可促使试管苗矮壮。     

光合细菌产辅酶Q10发酵条件的研究

利用均匀设计原理进行实验设计 ,对光合细菌R .capsulatusMT1131产辅酶Q10培养基配方及培养条件进行优化 ,结果当培养基中酵母膏质量浓度为 3 .13g·L- 1 ,硫酸铵 0 .8g·L- 1 ,Mg2 + 0 .6 4g·L- 1 ,Fe2 + 45 .2mg·L- 1 ,Mn2 + 18mg·L- 1 ,Co2 + 16mg·L- 1 ,培养基初始pH值为 7.0时 ,于 30℃ ,光照强度为 2 0 0 0Lx条件下培养 4天后 ,菌体中辅酶Q10质量浓度由 15 .2 13mg·L- 1提高至 2 0 .36 5mg·L- 1 ,产量提高约 33.87%。