Nisin高产菌株的高通量筛选

【目的】乳酸链球菌素(nisin)是一种天然生物活性抗菌肽,对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用,而用作食品的防腐剂。本研究通过建立高通量筛选方法,实现高效快速省力的高产菌株筛选,为工业上筛选高产菌株提供研究方案。【方法】通过对Lactococcus lactis ATCC11454菌株进行紫外诱变,获得2511株突变株。利用Biomek FXP自动工作站建立96微孔板的高通量筛选方法,突变株经高通量挑选、菌种培养及菌液稀释后,加入到生长至对数中期的藤黄微球菌中,采用改进后的比浊法快速检测nisin生物活性。用此方法对突变株进行初筛、复筛后可得到nisin高产菌株,并通过摇瓶发酵评估高通量筛选方法。【结果】确定比浊法检测的条件为:nisin活性稀释在10–25 IU/m L范围内,与藤黄微球菌反应2 h后检测藤黄微球菌的菌体量(OD600)。2511株突变株经过2轮高通量筛选,最终获得约50株产量提升的菌株,对其中8株进行摇瓶精确测量,显示产量均有提高,并且其中一株产量提升了30%,成功建立了高通量筛选nisin高产菌株的方法。【结论】利用比浊检测法,在其基础上成功建立高通量筛选高产nisin菌的方法,经过初筛复筛,整个周期由1人耗时5 d即可完成2511株突变株的筛选工作。相较于传统的选育方法,高通量筛选具有快速、稳定、高效的特点,提高了筛选效率,缩短了选育周期,是工业上筛选高产nisin菌的有效手段。     

抗菌活性放线菌的界面微滴移液互作分离筛选方法

【背景】放线菌是天然产物的宝库,目前应用于临床的天然抗生素有70%来源于放线菌的次级代谢产物。随着细菌对传统抗生素耐药问题的日趋严重,如何从自然生境中高效筛选新型活性放线菌资源并发现新型抗生素成为当前微生物学者面临的重要挑战。通过传统方法筛选活性放线菌不仅费时费力、试剂耗材消耗量大,并且筛选通量非常有限,难以对自然样品中的复杂微生物群落进行整体全面的解析。【目的】提出一种基于多孔板液滴阵列培养的新策略,可高通量筛选抗菌活性放线菌。分析模式放线菌在微液滴中的培养特征与筛选条件,为进一步建立基于液滴阵列技术的超高通量活性放线菌筛选平台奠定基础。【方法】采用界面移液技术,将传统的多孔板高通量筛选体系微缩至1μL水平,在油相填充的多孔板(96孔板)中生成微升培养液滴阵列,每个微孔液滴中封装一个放线菌孢子或菌丝团。经过短期培养,放线菌在微滴中完成菌丝分化与次级代谢产物的分泌。这时,通过第二步界面移液技术与液滴融合加入带有荧光标记的指示菌,通过全菌拮抗筛选定位活性目标菌株,并将活性谱转化为量化的荧光数值。【结果】通过对模式放线菌的测试发现,放线菌菌丝可以在微液滴中达到最佳培养状态,并积累足够的生物质与代谢物,对荧光指示菌有明显的抑制作用。【结论】通过建立上述基于微孔板液滴阵列的高通量筛选技术,能从单细胞水平快速筛选出具有抑菌活性的菌株,显著节约了筛选成本并提高了筛选通量,为新型活性天然产物的发现提供了一种新的简单有效的筛选方法。     

核黄素工业菌株高通量筛选方法的建立和应用

枯草芽孢杆菌是主要的核黄素工业生产菌之一,高通量筛选技术是选育获得高产核黄素菌株的关键环节。为实现工业菌种选育与高通量筛选技术相结合,对流式细胞分选、液滴微流控分选和96孔板筛选在核黄素工业菌株筛选中的应用进行了研究,并对96孔板筛选方法进行了优化。在流式细胞分析中,来源于同一株工业菌的低产菌株P1与高产菌株R1的细胞荧光与核黄素产量不成正相关。在液滴微流控分析中,P1和R1的发酵液上清荧光与核黄素产量成正相关,然而液滴分选后活细胞的数量很少。在96孔板筛选实验中,振荡培养后P1和R1的发酵液荧光分别为22 264 a.u.、28 647 a.u.;静置培养后荧光分别为7 095 a.u.、10 189 a.u.,核黄素产量与荧光成正相关,且二者荧光差异显著。利用96孔板静置培养的方法对工业菌株S1的突变体库进行筛选,得到的优选菌株核黄素产量为2.53 g/L,相比S1提高了15%。这些结果表明96孔板静置培养-荧光检测筛选可以应用于核黄素工业生产菌产量的提高。     

一种产邻苯二酚菌株高通量筛选方法

目的：对产邻苯二酚菌株进行筛选。方法：采用前期筛得的产邻苯二酚菌为出发菌株,通过硫酸二乙酯诱变的方法使该菌株突变,同时建立96孔板培养和酶标仪检测方法对产邻苯二酚菌株进行高通量筛选。结果：硫酸二乙酯的终浓度为0.1%,诱变时间为8 min的条件下,突变菌致死率为84.5%,突变效果最好。筛选培养基中吸光值（495nm）和富集培养基中菌液浊度值（OD630）的加和值较大的突变菌株产邻苯二酚能力高。通过诱变和筛选得到的菌株,产邻苯二酚浓度可达0.87mg/ml,比出发菌株的提高了262.5%。经过形态学和生理生化反应,初步鉴定该菌株属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。结论：硫酸二乙酯诱变和96孔板筛选的方法能以高通量方式快速筛选出产邻苯二酚菌株。     

高通量筛选诱变菌株降低黄酒发酵氨基甲酸乙酯前体积累

【目的】氨基甲酸乙酯是发酵食品中普遍存在的一种潜在危害物。黄酒中氨基甲酸乙酯的前体主要是尿素和乙醇。本研究通过高通量筛选策略降低黄酒发酵过程中尿素的积累,从而降低氨基甲酸乙酯积累。【方法】以一株黄酒生产工业菌株酿酒酵母XZ-11为研究对象,采用ARTP诱变和高通量筛选策略,获得尿素积累量较低菌株。使用实时定量PCR技术检测氮代谢中尿素代谢和转运相关基因(DUR1,2和DUR3)的变化。【结果】筛选得到一株尿素高效稳定性利用菌株5-11C。其尿素积累量比酿酒酵母XZ-11降低了50.6%。实时定量荧光PCR结果表明,与尿素代谢和转运相关的基因(DUR1,2和DUR3)表达量分别提高了3.3和2.2倍。【结论】高通量筛选策略可以用于降低黄酒生产过程中氨基甲酸乙酯前体尿素的含量。由于未采用基因工程手段,避免了可能的法规问题,消费者易于接受,在发酵食品行业具有较好的应用前景。     

啤酒酵母工业菌株单倍体的诱导、分离和鉴定

【目的】探索适宜的方法进行啤酒酵母工业菌株单倍体的诱导、分离和鉴定,为啤酒酵母改良和遗传学研究提供便利。【方法】首先,选择产孢效果最好的培养基进行产孢诱导,诱导产生的孢子在YPD培养基上形成菌落后,用流式细胞技术检测其DNA含量,进而判断其倍性;单倍体菌株的交配型通过MAT-PCR和杂交实验确定。【结果】啤酒酵母工业菌G-03通过产孢诱导和孢子分离、富集后得到26株菌,最终通过流式细胞技术确定了其中4株为单倍体,MATa和MATα型各2株。通过扫描电镜法观察4株单倍体菌株及出发菌G-03的细胞形态,发现单倍体菌株的形态和出发菌有较大区别,单倍体菌株长期培养没有假丝生长的现象发生。【结论】啤酒酵母工业菌单倍体育种较为困难,严格的单倍体筛选、鉴定尤其具有挑战性。     

阿维菌素生产菌的常压室温等离子体诱变育种及培养基优化

【目的】通过诱变筛选技术选育阿维菌素高产突变株,对其发酵培养基进行响应面优化,提高阿维菌素产量。【方法】采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术,结合链霉抗性和卡那霉素抗性筛选法及96深孔板高通量筛选法,筛选阿维菌素高产株。在单因素实验的基础上,应用响应面分析法对其发酵培养基进行优化,最后确定最佳培养基配方。【结果】获得一株遗传性状稳定的阿维菌素高产株K-1A6,其阿维菌素产量达到4.22 g/L,比出发菌株9-39提高了23.4%,在最佳培养基中阿维菌素产量达到5.36 g/L,较优化前提高了27.01%。【结论】通过对阿维链霉菌9-39菌株进行ARTP诱变筛选及发酵培养基优化研究能显著提高阿维菌素的产量。     

常压室温等离子体(ARTP)诱变及高通量筛选那西肽高产菌株

采用新型常压室温等离子体(ARTP)诱变活跃链霉菌(Streptomyces actuosu),并应用抑菌圈和48孔板培养方法高通量筛选高产那西肽菌株。研究表明抑菌圈径的大小与48孔板效价之间以及48孔板效价与摇瓶效价之间均有较好的相关性,系数R分别达到0.534和0.896。通过多轮ARTP诱变及高通量筛选最终获得了3株相对效价提高50%以上的遗传性能稳定的突变株。ARTP诱变技术作为获得那西肽高产菌株的有效途径,与传统摇瓶发酵筛选相比,48孔板及抑菌圈法能显著提高那西肽高产菌株的筛选效率。     

人胰腺α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人胰腺α-淀粉酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人胰腺α-淀粉酶;利用酶的催化特性建立α-淀粉酶抑制剂筛选模型;应用该模型对放线菌发酵液冻干物进行高通量筛选;通过构建16S rRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】成功克隆、表达了具催化活性的人胰腺α-淀粉酶;建立了α-淀粉酶抑制剂的筛选模型;对近2000株放线菌的发酵液冻干物进行高通量筛选,最终得到14株α-淀粉酶抑制剂产生菌株,且在分类学上具有丰富的菌种多样性。【结论】本研究建立的α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型淀粉酶抑制剂类降糖药物的开发。     

高效石油降解菌群的构建及对芳香烃化合物萘的协同降解性能

【背景】石油作为一类混杂有机化合物,一旦产生污染就会对人类和环境造成严重的危害。【目的】从新疆石油污染土壤中分离筛选石油降解菌,为石油污染土壤的生物修复提供数据支持及技术参考。【方法】以石油为唯一碳源,通过富集培养、筛选分离得到123株单菌,根据菌落形态挑选出30个不同形态菌株,通过16S rRNA基因序列确定其种属,构建系统发育树;通过原油降解实验筛选出高效石油降解菌,以芳香烃的标志化合物萘为唯一碳源筛选出高效降解菌株,并分别筛选可降解水杨酸、邻苯二酚的菌株。【结果】分离筛选出5株高效石油降解菌,降解率高于85%;萘、水杨酸和邻苯二酚降解菌株各获得一株,将3种菌株按照1:1:1的接种比例对萘进行降解,萘的降解率从单菌60.74%提升到89.40%,菌株间的分工协作可以提高有机物的降解效率。【结论】筛选得到的菌株丰富了石油降解微生物菌种库,不同微生物菌株之间的分工协作为石油污染物的降解提供了新思路,为进一步研究石油污染治理提供参考。     

基于流式细胞仪高通量分选的深海微生物单细胞培养

【目的】建立适用于海洋微生物的流式细胞分选与高通量单细胞培养的方法,通过该方法从印度洋深海样品中分离微生物纯培养菌株。【方法】利用流式细胞仪单细胞分选功能,以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光信号代替荧光信号作为分选逻辑,对深海水体和沉积物样品中微生物进行单细胞高通量分选和培养。【结果】确定了流式细胞分选的区域和条件,发现所建立方法适于分离海洋水体微生物,而不是沉积物微生物。从印度洋深海水体样品中获得61个潜在新菌株,分属于6个新属种,占分离菌株总数的26.29%,其16S rRNA基因序列与已培养的模式菌株相似性为89.79%–95.37%。【结论】本研究所建立的方法有助于提高发现海洋微生物新物种的效率,获得更多新的海洋微生物资源。     

东乡野生稻内生细菌Fse32拮抗作物病害真菌及对水稻的促生活性

【背景】植物种子是植物内生菌筛选的重要原料,从中能够分离得到具有巨大应用价值的内生菌株。【目的】为发掘优良的种子内生细菌资源,对分离自东乡野生稻种子的内生细菌Fse32进行鉴定并研究其抗病原真菌和促生活性。【方法】通过形态学观察、生理生化特征和16SrRNA基因序列分析进行菌种鉴定,采用拮抗试验检测抑制病原真菌的活性,通过促生能力测定试验、水稻种子萌发及盆栽试验评价该菌株的促生效果。【结果】内生细菌Fse32鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,命名为Burkholderia gladioli Fse32。拮抗试验结果显示,菌株Fse32对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大豆核盘菌(Sclerotinialibertiana)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)均有较好的抑制作用,吲哚乙酸(indole-3-aceticacid,IAA)产率为17.95mg/L,能产铁载体,其A/Ar比值为0....     

广陈皮外源真菌的组成及产毒真菌分析

【背景】广陈皮为药食同源中药材,在高温、高湿且贮存不当的条件下容易发霉,从而产生毒素,严重威胁陈皮的质量安全。【目的】分析广陈皮表面外源真菌的组成及其产生毒素的真菌。【方法】采用平板稀释法分离广陈皮表面外源真菌,利用分生孢子形态特征及DNA序列分析进行真菌鉴定,采用高效液相色谱-三重串联四极杆质谱联用技术对青霉属和曲霉属进行产毒检测。【结果】从广陈皮表面分离外源真菌共132株,鉴定为子囊菌亚门（Ascomycota,98.48%）和毛霉菌亚门（Mucoromycota,1.52%）,包括散囊菌纲（Eurotiomycetes,95.45%）、座囊菌纲（Dothideomycetes,3.03%）和毛霉纲（Mucoromycetes,1.52%）。分离活动曲霉属（Aspergillus spp.）菌株共77株,为广陈皮药材外源真菌的优势菌,青霉属（Penicillium spp.）次之。毒素检测筛选出1株产毒真菌,鉴定为黄曲霉（Aspergillus flavus） JXCP1-3。该菌株产生黄曲霉毒素B₁ （aflatoxin B₁,AFB<...     

三种松树内生真菌的分离鉴定及其对红脂大小蠹伴生真菌的拮抗作用

【背景】松树的内生真菌会影响红脂大小蠹及其伴生真菌的生长及扩散,从而影响红脂大小蠹的入侵。【目的】掌握赤峰地区红脂大小蠹寄主树种内生真菌的物种多样性,筛选对其伴生菌有拮抗作用的菌株,为红脂大小蠹的生物防治提供资源。【方法】采用组织分离法、形态学鉴定和internal transcribed spacer (ITS)序列分析相结合的方法对红脂大小蠹寄主树种油松、樟子松和潜在寄主落叶松进行内生真菌多样性研究,并用两点对峙法进行拮抗菌株筛选。【结果】松树内生真菌鉴定为2门6纲10目18科19属,其中落叶松韧皮部分离到的内生真菌数量最多,为39株,隶属于9属12种,真菌检出率为43.33%;油松次之,为30株,隶属于7属8种,真菌检出率为33.33%;樟子松最少,为29株,隶属于10属13种,真菌检出率为32.22%。3个树种的内生真菌相似性较低,无共有的菌种,青霉属(Penicillium)和篮状菌属(Talaromyces)是唯二的共有菌属,且青霉属在3个树种中均为优势菌属。平板对峙结果表明90%以上的树木内生真菌均能够与伴生真菌形成稳定的对峙,抑制率在50%-86%之间,且Phialocephala sp.和Pochonia bulbillosa对伴生菌的抑制率能高达93.7%。【结论】松树韧皮部的内生真菌具有较高的生防潜力,Phialocephala sp.和P. bulbillosa对红脂大小蠹伴生菌有较好的抑制效果,可作为红脂大小蠹的生防资源。     

花生种子相关促生菌分离鉴定及功能评价

【背景】利用微生物促进植物健康生长是农业可持续发展的重要方向之一,而种子相关的促生菌可在植物生命周期早期与植物相互作用,对植物健康生长具有重要意义。【目的】发掘与利用种子相关促生菌的前提是筛选获得促生菌菌种资源,验证其益生能力,为其进一步应用与机理研究提供依据与支持。【方法】以花生种子为研究对象,从种子表面及种子内部分离纯化多株菌,测定菌株的固氮、解磷、解钾、吲哚乙酸合成和铁载体合成等促生能力,并验证菌株对常见植物病原菌的生长抑制特性;通过16S rRNA基因序列进行系统发育分析,确定分类地位;通过生物膜形成能力及根际定殖能力测定菌株在植物根际的生存能力;最后通过催芽及盆栽试验测定菌株对花生种子发芽及幼苗生长的影响。【结果】从花生种子表面、种子内和胚根内分离筛选到41株菌,均有吲哚乙酸合成能力,其中35株有固氮能力,2株有铁载体分泌能力,14株有植物病原菌生长抑制能力。各选一株为代表的菌株,即PS3、PE5和PR5,经16S rRNA基因序列比对分析鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)。PS3、PE5和PR5均可在MSgg液体培养基表面形成褶皱较强的生物膜,也可在花生根际形成有效定殖。催芽试验结果表明经过促生菌浸种后花生种子萌发率明显提高,在第2天时,PS5将发芽率由14.17%提高至38.33%,PE5发芽率提高至30.83%,PR5发芽率提高至39.17%。三株菌能够明显促进花生幼苗生长,PS5对花生幼苗苗高、根长、鲜重和干重分别提高21.82%、22.20%、37.11%和35.64%,PE5分别提高17.45%、18.93%、26.10%和21.18%,PR5分别提高23.11%、23.92%、38.66%和37.47%。【结论】筛选获得的花生种子相关促生菌,具有促进植物生长的潜力,明显促进种子萌发及幼苗生长,是良好的促生菌生物资源,具有较好的应用潜力。     

甲基营养菌MB200中mutS的缺失及高浓度甲醇和甲醛诱变

【背景】甲基营养菌(Methylobacterium)是一类能够以单碳或非C-C键低碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛等)为底物生长,并可生产多种代谢产物如氨基酸、工业酶和辅助因子、多羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)、多糖和类胡萝卜素等的革兰氏阴性细菌。【目的】通过突变甲基营养菌MB200的mutS基因,在胁迫条件下定向诱导,以获得可以耐受高浓度甲醇和甲醛的生产菌株。【方法】利用三亲本结合构建mutS基因缺失的高突变菌株MB200sTB,逐步提升培养液中甲醇、甲醛的浓度进行定向诱导突变,对获得的高耐受性突变株进行回补,分析菌株的生长情况。【结果】构建了mutS基因的缺失突变体MB200sTB,并且得到了高耐受甲醇和甲醛的菌株MB200sHBc和MB200sHBq。MB200sHBc与野生株MB200相比其甲醇耐受性得到了极显著的提高,甲醇耐受浓度从8g/L提升到44g/L,但生长量不受影响。MB200sHBq在以甲醛为0.45g/L的碳源条件下,生长量相较于野生型MB200提高了1.69倍。【结论】通过定向诱导缺失mutS基因的突变体,可获得具有生产应用潜力的...     

肺囊康定产生菌Glarea lozoyensis线粒体基因组序列的再分析

[目的] Glarea lozoyensis是抗真菌药物卡泊芬净的产生菌,其突变菌株ATCC 74030的线粒体基因组已被报道。我们此前的研究发现诱变剂能引起该菌某些细胞核基因的突变,但诱变剂是否也能引起线粒体DNA序列的改变并不清楚。[方法] 组装野生型菌株ATCC 20868的线粒体基因组,并与发表的突变型菌株ATCC 74030的线粒体基因组进行比较。通过PCR验证野生和突变菌株线粒体基因组间表现差异之处,并利用正确的线粒体基因组序列进行新的分析。[结果] 我们成功组装出野生型菌株ATCC 20868的线粒体基因组,通过比较其与发表的ATCC 74030的线粒体基因组序列,发现存在6处单核苷酸变异位点和2处具有长度差异的区域。然而,随后的PCR验证和序列比较并没有发现2个菌株间存在这些差异。最初观察到的碱基差异是因为发表的ATCC 74030线粒体基因组存在序列错误。有趣的是,在Glarea lozoyensis的线粒体基因组中,我们发现存在3个具有内含子的tRNA基因和1个rnpB基因。同时,该菌线粒体基因组中存在多种重复序列,在其线粒体和细胞核基因组间也存在明显的DNA片段重复事件。[结论] 诱变剂没有引起G. lozoyensis线粒体DNA的任何改变;发表的ATCC 74030的线粒体基因组存在序列错误。我们报道G. lozoyensis正确的线粒体基因组序列,并且发现该菌线粒体和细胞核基因组间频繁的基因交流。     

沈阳地区北虫草野生与市售菌株人工培育子实体的蛋白质组学比较

【背景】北虫草作为冬虫夏草的代用品,具有与冬虫夏草类似的药理活性,其富含的蛋白质和氨基酸通常作为衡量真菌营养价值的重要指标,从中分离纯化具有潜在临床应用价值的蛋白质或多肽,已成为一个研究热点。【目的】检测沈阳北虫草野生与市售菌株人工培育子实体的蛋白质组成,分析相同培育条件下获得的蛋白种类、数量及其功能的差异,为深入研究鉴定沈阳地区北虫草药用蛋白和针对性驯化提供了蛋白质组学数据基础。【方法】采集沈阳棋盘山野生北虫草菌株,与市售人工栽培北虫草菌株同期分别经组织分离、液体发酵后培育获得子实体,通过蛋白提取、胰酶酶解后,采用非标定量技术液相色谱-质谱联用方法,对野生和市售来源培育的子实体样本进行定量蛋白组的研究。【结果】共鉴定到9 233条特异性肽段和1 923个蛋白,其中含有1 163个可定量蛋白,野生来源培育子实体有214个蛋白表达发生上调,181个蛋白表达发生下调,对这些差异蛋白进行功能富集分析发现,其主要参与能量生产/转换、氨基酸转运/代谢、抗氧化功能。在相同的营养摄取条件下,野生来源培育菌种在各个能量代谢、氨基酸代谢功能中的相关蛋白表达量高于市售来源培育的菌种。野生来源培育菌种的一种抗氧化重要蛋白(Gene Name:ISF_02112)表达量远远高于(Fold Change9)市售来源培育菌种。同时与抗氧化和代谢功能相关的差异蛋白有22个。【结论】沈阳地区北虫草野生菌株经适当人工培育会保留部分优良的生物学特性,2种来源菌株培育的子实体具有丰富及优异抗氧化功能的蛋白,子实体蛋白的抗氧化能力与其整体代谢能力相关。本研究结果为深入研究鉴定北虫草药用蛋白和针对性驯化提供蛋白质组学数据基础。