3株罗伊氏乳杆菌生物学特性的分析比较

【目的】对3株罗伊氏乳杆菌的生物学特性进行分析比较,为后期生产应用提供一定的参考。【方法】对实验室保藏的3株罗伊氏乳杆菌的生长曲线、pH曲线、耐受人工胃液能力、耐受猪胆盐能力、黏附能力、抑菌能力和对抗生素的耐药性等特性进行了分析比较。【结果】3株菌生长趋势大致相同;3株菌对人工胃液均具有良好的耐受性,且可以有效地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长;菌株L0和L2对高胆盐的环境耐受性较差,菌株L1则对高胆盐环境具有极强的耐受性;菌株L1和L2具有很强的黏附能力;3株菌对20种抗生素表现出不同的耐受性。【结论】菌株L1的生物学特性明显优于其他两株菌株,有利于后期的生产应用。     

金黄色葡萄球菌hmp基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能力分析

摘要：【目的】:构建金黄色葡萄球菌RN6390黄素血红蛋白(flavohaemoglobin, HMP)基因缺失突变株,研究其抗一氧化氮(Nitric Oxide, NO) 能力及其在细菌生物被膜形成中的作用。【方法】：根据同源重组技术的原理,利用PCR扩增RN6390的hmp基因上下游同源臂,经过抗生素和温度交替培养筛选hmp基因缺失突变株,利用基因组PCR、定量PCR对突变菌株进行鉴定。以硝普钠（SNP）为NO供体,检测了hmp基因缺失菌株的抗NO能力,并初步研究了hmp基因在生物被膜形成中的作用。【结果】：成功构建了RN6390的hmp基因缺失突变株,外源NO能够诱导菌株hmp基因的表达,hmp基因缺失菌株抗NO能力明显下降,但其生物被膜形成能力有明显提高。【结论】：获得了RN6390的hmp基因缺失突变株,该突变株的获得为进一步研究hmp基因的生物功能,以及细菌内源性NO的作用奠定了良好的技术平台。     

高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7诱变株的筛选

【目的】对野生菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变育种,筛选高产DHA突变株。【方法】采用UV诱变和化学药物胁迫筛选方式,以菌株的生物量、油脂产量、DHA产量作为筛选指标,获得高产DHA突变株。【结果】经鉴定获得一株DHA高产突变株PKU#PM003,该菌株传代4次后仍保持较好的遗传稳定性。摇瓶发酵后,PKU#PM003生物量产量高达6.62 g/L,比原始菌株5.95 g/L提高了11.26%,脂肪酸含量高达4.01 g/L,比原始菌株3.18 g/L提高了26.1%,DHA在脂肪酸中所占比例由29.97%增加到33.43%,产量提高了41.01%,油脂突变效果显著。【结论】突变株PKU#PM003可作为性状优良的工业化发酵生产菌种,并在DHA产量提升上仍具有巨大的空间。     

粗糙脉孢菌26 S蛋白酶体三个亚基缺失菌株的构建及表型分析

【目的】通过构建26S蛋白酶体的3个亚基RPN4、RPN7、RPN10的缺失突变菌株,研究这些缺失突变体的表型,进而探究这3个亚基在蛋白酶体中的作用。【方法】采用同源重组基因敲除技术、电转化、粗糙脉胞菌杂交、子囊孢子萌发及PCR鉴定等方法分别获得3个调节亚基的基因缺失突变体。利用racetube和平板生长法进行突变体表型检测。【结果】得到rpn4和rpn10的缺失突变纯合体及rpn7缺失突变异核体菌株。【结论】与野生型相比,rpn7KO(ku70RIP背景)突变体的菌丝生长及产生分生孢子的能力显著减弱;rpn4KO突变体在生长初期的菌丝生长缓慢,而后期的产孢能力与野生型无显著差异;rpn10KO突变菌株的表型介于上述两种突变体的表型之间。这些结果表明26S蛋白酶体的这3个亚基对脉胞菌的生长和发育至关重要。     

MdrL外排泵在单核细胞增生李斯特菌对苯扎氯铵耐受中的作用

【背景】季铵盐类消毒剂特别是苯扎氯铵(Benzalkonium chloride,BC)在食品工业中的广泛应用导致单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对BC的敏感性下降。外排泵是介导Lm对BC耐受的主要机制。【目的】调查Mdr L外排泵在Lm对BC耐受中的作用。【方法】利用同源重组技术构建mdr L基因缺失株。比较野生株EGD-e和突变株Δmdr L在对BC的耐受性、亚致死浓度BC(2μg/m L)胁迫下的生长情况以及致死浓度BC(16μg/m L)下的存活率等方面的差异。【结果】构建mdr L基因缺失株Δmdr L及回复突变株CΔmdr L。mdr L的缺失不影响菌株对BC的最小抑菌浓度。生长曲线测定结果显示,与野生株相比,突变株在亚致死浓度BC作用下的生长迟滞期延长、平均最大生长率和平均最大光密度值均降低。当BC浓度为4μg/m L时,梯度稀释后的野生株和突变株在平板上的生长显现出明显的差异。与野生株相比,突变株在致死浓度BC作用下的存活率降低2个log值。透射电镜的观察结果显示,加入BC后,突变株的细胞明显变细长。此外,野生株和突变株对溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)的积累和外排无明显差异。【结论】Mdr L外排泵介导Lm对BC的耐受,但是与Lm对EB的外排无关。     

绿针假单胞菌HT66中ompR基因的功能

【背景】植物根部存在大量对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌,是当前农业微生物研究的热点之一。其中,绿针假单胞菌HT66是一株可高效合成吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的环境友好型生防菌株。【目的】探究在绿针假单胞菌HT66中ompR基因的生理功能,以及其对菌株生防作用的影响。【方法】通过基因无痕敲除的方法构建HT66菌株的ompR基因缺失突变株,对比研究突变株与野生株在生长速率、渗透压感应、生物膜的合成、pH耐受性、群集运动和PCN产量的变化。【结果】与野生株相比,ompR基因缺失突变株的细胞生物量微量减少,生物膜的合成减少31.5%,群集运动以及对渗透压和pH的耐受性明显下降,但是其PCN产量较野生株提高了57.8%。【结论】在HT66菌株中,ompR基因对其运动性、环境耐受性和生理生防功能均有一定程度的调控作用。本研究丰富了绿针假单胞菌的代谢通路,此报道将对后续PCN合成机制的研究和应用提供一定的理论依据。     

多轮次胁迫驯化及多因子复合筛选丁醇高产菌

【目的】从陕西省石泉县玉米地土壤中分离获得一株产丁醇菌株并提高其丁醇耐受性和丁醇产量。【方法】采用自行设计的多因子复合筛选方法和丁醇胁迫驯化处理,在获得丁醇高产菌株的同时提高菌株的丁醇耐受性。【结果】野生菌株D64经多轮次丁醇胁迫驯化处理和多因子复合筛选,分离获得突变株T64,其丁醇耐受性明显提高,能在丁醇浓度为20 g/L的复合筛选培养基上正常生长,发酵7%玉米醪丁醇产量由13.35 g/L提高到15.18 g/L,总溶剂(丙酮、丁醇、乙醇)达到21.8 g/L。【结论】采用长时间且丁醇浓度呈梯度渐进增加的胁迫驯化方式,可使菌种在丁醇的环境中不断进化并有效地提高菌株对丁醇的耐受性。多因子复合筛选方法较其他单一因子筛选方法更为有效,能较快获得丁醇高产菌。     

甲基营养菌Methylobacterium sp. MB200中部分一碳代谢相关基因的定位及mtdA和mtdB 基因的克隆研究

以甲基营养细菌Methylobacterium sp. MB200为出发菌株,首先利用质粒转座子(pTnMod-RKm’)构建了目的菌株MB200的部分突变体库,获得能够在双抗性MMII板上生长的突变体共11552株,然后在双抗性MMI板上复筛获得不能够利用甲醇的突变体333株(初步认为是一碳代谢途径被破坏的突变株),为一碳代谢相关基因的克隆研究奠定了基础。随后利用TAIL-PCR技术快速准确地从突变体库中定位了部分与一碳代谢相关的基因,并根据pTnMod-RKm’具有复制起始位点能够快速克隆插入位点侧翼序列的特性克隆到mtdA和mtdB基因的全序列并进行了初步分析。     

新一代糖化酶高产菌株的选育及其工业应用

【目的】建立对糖化酶生产菌种黑曲霉随机突变文库进行筛选的方法,以获得糖化酶酶活提高的突变菌株。【方法】以一株可产糖化酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger X1为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变获得突变文库,采用葡萄糖的结构类似物——2-脱氧葡萄糖进行筛选,并在筛选过程中逐渐提高2-脱氧葡萄糖浓度,定向选育具有2-脱氧葡萄糖抗性、高产糖化酶的突变株。【结果】获得的高产突变菌株DG36摇瓶发酵糖化酶产量比出发菌株A.niger X1提高22.2%–33.8%,经工业水平50 m~3罐发酵测试,突变株DG36发酵128 h糖化酶活可达49094 U/m L,在相同发酵时间内,其酶活较出发菌株A.niger X1提高32.8%,发酵时间缩短16.9%。【结论】本研究开发了一种以2-脱氧葡萄糖为抗性标记选育高产糖化酶突变株的方法,所得突变株DG36遗传性状稳定,与出发菌相比具有菌丝粗壮、产酶期提前、糖化酶活高、发酵时间短、有利于发酵后处理的优点。     

BldM对密旋链霉菌Act12形态发育及抗生素合成的调控

【目的】以多效生防菌株——密旋链霉菌(Streptomyces pactum) Act12为研究材料，探究转录因子BldM对生防链霉菌Act12形态发育及抗生素合成的调控作用。【方法】通过基因工程手段构建bldM基因缺失突变株△bldM及过表达突变株OE-bldM，利用扫描电镜观察、抑菌实验、高效液相色谱检测和实时荧光定量PCR探究缺失突变株△bldM及过表达突变株OE-bldM与野生型(wild) Act12在形态发育、生长速率、寡霉素产量及抗病原菌能力等方面的差异。【结果】经测序验证bldM基因缺失突变体△bldM及过表达突变体OE-bldM均构建成功，其中△bldM寡霉素D产量明显降低且无法形成气生菌丝，而过表达突变株OE-bldM的气生菌丝更加密集，产孢更为丰富。与野生型菌株相比，OE-bldM的寡霉素D产量增加了23%，编码寡霉素核心合成酶基因的转录水平上调了2-3倍，抑菌活性显著增强。【结论】全局性转录调控因子BldM不但能影响Act12气生菌丝及孢子形成，并且参与正调控Act12寡霉素的合成，本研究结果为转录因子BldM的调控功能进行了新的挖掘和补充，并为后续深入研究密旋...     

一株耐盐甲基杆菌Methylobacterium sp.W-1的分离及促生潜能研究

[背景] 多种甲基杆菌属细菌对寄主植物有促生作用,其分布区域较广。筛选具有耐盐与促生特性的甲基杆菌属菌株可为微生物菌肥的开发提供依据。[目的] 从新疆乌尔禾地区盐渍土壤中筛选耐盐促生菌,对其培养基成分进行优化及促生能力进行研究,为微生物菌肥的开发提供依据。[方法] 采用阿须贝无氮培养基筛选耐盐菌株,对菌株进行基因序列分析及生理生化测定,采用平板试验法初步研究该菌对拟南芥的生长影响。[结果] 筛选出中度耐盐菌株W-1,经鉴定为甲基杆菌属（Methylobacteriumsp.）。菌株生长最佳无机盐为NaCl,最适浓度为1%–3%,最高耐受浓度达7%。最佳氮源为酸水解酪蛋白,产生长素最高达33.53 mg/L。溶磷能力达28.71 mg/L。菌株W-1接种拟南芥幼苗后叶绿素a和叶绿素b含量均高于对照组,同时对其根系发育有显著的促进作用。[结论] 菌株W-1促生性能显著,可为生物肥料制备提供菌种资源。     

富硒条件下蜜环菌菌株硒耐受性及胞外酶生物活性的研究

[目的]通过对蜜环菌(Armillaria mellea)的富硒驯化,研究各菌株硒耐受性、有机硒含量及生物活性的变化规律,从而获得生物活性更强的蜜环菌,并对富硒蜜环菌的生物学特征进行初步研究.[方法]以Na2SeO3为无机硒试剂对蜜环菌进行富硒驯化;采用氢化物原子荧光光谱法测定蜜环菌的硒含量,热水浴法测定蜜环菌的无机硒...     

单核细胞增多性李斯特菌谷胱甘肽还原酶GR的生物学特性

【目的】本文旨在构建单核细胞增多性李斯特菌谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)基因lmo1433(gr)缺失株,并研究GR在细菌生长和运动过程中发挥的作用及与谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx)系统间的调控关系,探究GR参与细菌抗氧化应激和致病力的生物学功能,为阐明氧化还原蛋白介导细菌环境适应和宿主内感染的机制奠定分子基础。【方法】利用细菌遗传操作系统构建获得gr缺失株及回补株后,通过分子生物学和感染生物学手段,比较野生株和突变株的运动性、生长能力、抗氧化应激、细胞黏附、侵袭和增殖能力;利用整合型质粒构建带GR启动子的荧光报告系统,并结合荧光定量分析GR受Grx调控的情况。【结果】缺失gr后李斯特菌在体外培养基中的生长能力未受明显影响,但在半固体培养基中的运动能力却显著增强;缺失gr后细菌在铜离子、镉离子以及肼中抗氧化应激能力增强,在H_2O_2中无差异;缺失gr后细胞黏附、侵袭和增殖能力均显著增强;荧光报告系统定量分析发现grx缺失后gr的启动子活性显著增强,表明Grx参与对GR的转录负调控。【结论】本研究首次证实了单增李斯特菌谷胱甘肽还原酶GR能调控细菌的运动能力,并且缺失GR增强了李斯特菌的抗氧化应激和感染宿主能力;首次证实了GR的自身转录受Grx负调控,但具体分子机制有待于深入探究。本研究有助于深入理解单增李斯特菌氧化还原蛋白的调控关系以及通过参与诸多生物学过程介导细菌体外环境适应及宿主内感染的分子机制,为防控胞内菌感染提供了新策略。     

CRISPR-Cas9系统与mazF介导的大片段删减法在酿酒酵母染色体大片段删减中的比较

【目的】比较CRISPR-Cas9系统与maz F法这两种酿酒酵母染色体大片段删减方法。【方法】分别用上述两种方法删减了酿酒酵母长度为26.5 kb的染色体大片段YKL072W-YKL061W,并比较了两种方法的转化效率、敲除成功率。【结果】利用CRISPR-Cas9系统平均得到5个转化子,但正确率为100%;maz F法得到约100个转化子,正确率略低于前者,为93%。【结论】两种方法均能高效删减酿酒酵母染色体大片段,CRISPR-Cas9系统正确率较高,操作简便省时;maz F法相对稳定,对目的基因无PAM位点要求。     

不同磷、硫及二氧化碳浓度对标志链带藻生长和碳水化合物积累的影响

【目的】为了研究不同磷、硫及二氧化碳浓度对标志链带藻(Desmodesmus insignis)生长与碳水化合物积累的影响,本实验以改良BG11培养基为基础,设计了8种不同初始K_2HPO_4浓度、8种不同初始MgSO_4浓度及4种二氧化碳浓度培养标志链带藻。【方法】采用干重法和苯酚-硫酸法分别测定其生物质浓度与总碳水化合物的含量。【结果】实验结果显示,在高磷浓度(0.460 mmol/L)下生物量达到最高为6.37 g/L,磷浓度为0.230 mmol/L (对照组)时总碳水化合物含量及单位体积产率达到最高,分别为45.40%(%干重)和0.20 g/(L·d)。不同初始MgSO_4浓度实验结果显示,高硫浓度有利于标志链带藻生长及碳水化合物的积累,生物量、总碳水化合物含量及单位体积产率分别在硫浓度为1.217 mmol/L、0.609 mmol/L和1.824 mmol/L时达到最高,分别为7.02 g/L、51.6%(%干重)及0.26 g/(L·d)。当二氧化碳浓度为3%(V/V)时,标志链带藻生物量、总碳水化合物含量及单位体积产率均达到最高,分别为6.81 g/L、44.03%和0.20 g/(L·d)。【结论】因此,磷浓度为0.230 mmol/L、硫浓度为1.824 mmol/L和二氧化碳浓度为3%时最有利于标志链带藻生长及碳水化合物的积累。     

嗜水气单胞菌zntR调控的生理功能及其机制研究

【目的】ZntR是一种金属调控蛋白,可催化锌外排基因的转录激活,防止细胞内二价Zn离子过量,但其对细菌生理功能的影响目前尚不清楚。【方法】本研究构建了嗜水气单胞菌ATCC7966(Aeromonas hydrophila,A.h)的zntR缺失株及补救株,对菌株的生物被膜形成能力、溶血活性、运动能力和响应金属离子胁迫等生理表型进行评估。【结果】敲除zntR基因的菌株对锌和铬离子胁迫敏感、对钴离子胁迫耐受,并且生物被膜形成能力下降、运动能力增强,这些表型在其补救菌株中均能得到恢复。进一步利用DIA定量蛋白质组学技术比较野生株和zntR缺失株的蛋白表达差异,发现ZntR还可能参与双组分系统、细菌的趋化性等代谢通路的调控。【结论】该研究结果可为今后深入探讨zntR转录因子参与细菌生理功能的调控机制提供理论依据。     

猪源乳酸杆菌与益生元组合筛选及其体外发酵特性

【目的】对3株乳酸杆菌和4种寡糖类益生元进行组合筛选,并探究其对猪结肠微生物体外发酵特性的影响。【方法】将3株乳酸杆菌(罗伊氏乳杆菌L45、植物乳杆菌L47和罗伊氏乳杆菌L63)分别添加至以菊粉(inulin)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)或乳果糖(lactulose)为唯一碳源的培养基中,结合菌株24 h的生长活性和产酸特性,筛选出最优组合;进一步利用体外发酵技术探究所筛选合生元组合对微生物和发酵特性的影响。【结果】L45和L63分别以FOS和Lactulose为碳源发酵时的生长曲线与葡萄糖相似,L47发酵Inulin和FOS的ΔOD600显著高于葡萄糖(P<0.05),且L47发酵Inulin产生的乳酸是葡萄糖的1.20倍,L47+FOS和L47+Inulin组合效应较好。体外发酵结果表明,与对照组相比,L47+FOS和L47+Inulin降低了发酵液中螺旋体门(Spirochaetes)的相对丰度,提高了乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度;L47+Inulin和L47+FOS显著提高了总短链脂肪酸含量(P<0.05);与L47+Inulin组相比,L47+FOS组乙酸和丁酸含量更高(P<0.05)。【结论】L47+FOS与L47+Inulin具有较好的组合效应,且具有改善猪结肠体外发酵的能力,提示L47+FOS和L47+Inulin作为合生元的发展潜力,两种组合在体内情况的效果有待深入研究。     

尼古丁降解菌SCUEC1菌株的分离及其降解基因

【目的】分离并鉴定1株具有尼古丁降解能力的细菌,研究其尼古丁降解特性并对其降解基因进行分析,为尼古丁微生物降解提供基础。【方法】从烟草种植地土壤中分离1株具有尼古丁降解能力的细菌,通过16S r RNA基因和生理生化特性对该菌株进行鉴定,检测该菌株尼古丁降解率与生长量的关系,并进一步对该菌株进行尼古丁浓度耐受性测定,采用高通量测序技术对菌株进行全基因组测序,BLAST比对分析尼古丁降解相关基因。【结果】筛选到1株具有尼古丁降解能力的细菌,经鉴定命名为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumerficience)SCUEC1菌株,根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解率可达到94.81%,该菌株在尼古丁浓度为0.50–5.00 g/L范围内生长良好且有较高的尼古丁降解能力。对根癌土壤杆菌SCUEC1菌株全基因组序列进行BLAST比对分析,推测该菌株的尼古丁降解代谢途径与中间苍白杆菌SYJ1菌株的尼古丁降解途径相似。【结论】本研究揭示了Agrobacterium tumerficienceSCUEC1菌株具备尼古丁降解特性,初步推测出尼古丁降解相关基因和降解代谢途径,为尼古丁微生物降解提供基础。     

一株可增强莱茵衣藻耐盐能力细菌MEZX29的分离与鉴定

【背景】水体中的藻类、细菌及这些微生物之间的相互作用对水体生态系统的功能有着重要作用。近年来,一些河流、湖泊等淡水资源的盐渍化不断加重,对水体生态系统造成严重影响。然而,高盐胁迫条件如何影响藻类与其他细菌的相互作用,以及是否存在能够促进藻类耐盐能力的有益细菌等问题尚未得到深入研究。【目的】分离和鉴定可以促进淡水藻类莱茵衣藻抗盐能力的细菌,并开展相关机制分析。【方法】通过富集培养、筛选和共接种实验,获得可以促进衣藻耐盐的细菌;基于活细胞浓度、叶绿素含量等参数评价衣藻在不同条件下的生长能力;对菌株进行16S rRNA基因序列分析和基因组分析,预测其可能的菌藻相互作用机制。【结果】获得一株在250-290 mmol/L NaCl条件下可以显著增强衣藻耐盐能力的菌株MEZX29,16S rRNA基因序列分析表明,该菌可能属于Rhodococcus qingshengii;基因组分析结果表明,该细菌含有参与糖代谢、乙烯合成、生物膜形成等途径的基因,这些基因可能在促进衣藻抗盐过程中起到重要作用。【结论】Rhodococcus qingshengiiMEZX29可以增强莱茵衣藻21gr抵抗高盐胁迫的能力,为研究藻类与其他微生物之间的有益相互作用提供了新的材料。     

海假交替单胞菌fliC-02330基因缺失影响生物被膜形成及厚壳贻贝幼虫附着变态

【背景】假交替单胞菌属是一种广泛分布于海洋环境的革兰氏阴性细菌,存在于海底沉积物中,能分泌大量的胞外产物形成海洋微生物被膜,从而诱导海洋无脊椎动物的附着。【目的】探究海假交替单胞菌鞭毛蛋白fliC基因对生物被膜形成及厚壳贻贝诱导活性的影响。【方法】通过基因敲除构建海假交替单胞菌fliC-02330基因缺失突变菌,研究突变菌和野生菌菌落形态、生物被膜形成能力、胞外物质以及对厚壳贻贝幼虫附着变态的诱导能力等的差异性。【结果】与野生菌相比,突变菌菌落表型出现褶皱,运动能力下降,形成被膜膜厚增加,以及对幼虫附着变态诱导活性下降。共聚焦扫描发现,fliC-02330基因缺失突变菌胞外多糖含量下降,而蛋白含量上升。【结论】海假交替单胞菌鞭毛蛋白fliC-02330基因缺失促进生物被膜形成,但抑制厚壳贻贝幼虫附着变态。本研究为探究细菌鞭毛蛋白基因与厚壳贻贝幼虫的作用机制,以及后续进一步探索微生物参与海洋无脊椎动物附着变态提供一定的理论依据。