水稻叶片硝酸还原酶mRNA的体外翻译

水稻叶片总RNA经Oligo(dT)—Cellulose柱层析分离Poly(A)~+RNA。在往层析中采用变温洗脱的方法,可减少rRNA的混杂,提高mRNA的纯度和体外翻译活力。它对麦胚无细胞系统蛋白质合成的促进可稳定在10倍,有时高达20多倍。NR—mRNA的体外翻译产物可用以NR为载体的火箭免疫电泳方法进行鉴定,其量可用火箭峰内的放射强度来表示。     

鲮鱼垂体Poly(A)~+RNA的分离和纯化及其生物活性鉴定

本文利用快速保温法分离纯化了鲮鱼垂体Poly(A)~+RNA,并首次在北农大“白粒146号”小麦麦胚体系中进行了体外翻译活性测定,对鲮鱼Poly(A)~+RNA其最适镁离子浓度为1.7mmol/L,最适Poly(A)~+RNA浓度为0.12μg/50mL,但钾离子浓度及预保温对蛋白质的合成影响不大。实验结果表明鲮鱼垂体Poly(A)~+RNA的体外蛋白翻译活性达对照组的22倍。由于改进了方法,简化了操作程序,因此使鲮鱼垂体Poly(A)~+RNA的翻译活性大大提高了。     

水稻种子发育过程中Poly(A)RNA和蛋白质水平的变化

我们用[~3H]—Poly(U)饱和杂交的方法分析了水稻种子发育过程中Poly(A)含量和Poly(A)RNA水平的变化。胚乳发育过程中,Poly(A)含量和Poly(A)RNA水平均于开花后11天达到高峰,比蛋白质高峰出现时间约早10天。随着胚乳的成熟,蛋白质水平在开花后6～21天持续增长。但 Poly(A)含量和Poly(A)RNA水平却急剧下降。因此,在胚乳发育早期合成的Poly(A)RNA中,可能有部分不是直接用于蛋白质的合成。在胚的发育过程中,Poly(A)含量和Poly(A)RNA水平分别出现三次高峰。开花后30天,每胚含有5.94ng Poly(A)RNA,约占胚总RNA的0.097％,为稻胚中贮存的mRNA存在提供了一个直接的证据。     

多聚腺苷酸结合蛋白的结构与功能

多聚腺苷酸结合蛋白[poly（A）-binding protein,PABP]是一类可以与mRNA 3′端Poly（A）结合的高度保守的蛋白质,可通过与Poly（A）的结合参与mRNA的翻译并调节其稳定性。PABP在脊椎动物配子发生和早期胚胎聋亨中也发挥重要的作用。PABP成员还在不断的发现之中,不同类型的细胞中具有结构和功能各异的Poly（A）结合蛋白。     

以CB—F83—Oligo（dT）—纤维素批量亲和层析分离poly（A）RNA

Poly(A)RNA分离是反向转录cDNA,构建cDNA文库以及进行差异杂交等的基础工作,也是改善RNA凝胶吸Ep和S_1核酸酶保护实验质量的基本措施。Poly(A)RNA的分离主要采用Oligo(dT)-纤维素柱亲和层析的方法。我们在非洲爪赡卵母细胞及早期胚胎Poly(A)RNA的分离过程中,先后使用了Poly(A)Quick Column(Stratagene产品)和 Oligo(dT)Cellulose,Type 7(pharmacia产品)柱亲和层析以及CB-F 83-Oligo(dT)-纤     

用钙沉淀法分离植物poly(A)-mRNA

本文对Lendes等人用钙沉淀poly(A)—mRNA的方法作了改进。在不加poly(A)的情况下,适当增加总RNA浓度,用15mM CaCl_2沉淀poly(A)—mRNA。使用改进的方法能够得到大量的poly(A)—mRNA。用改进法制各的poly(A)—mRNA;可以用poly(U)—Sepharose4β或oligo (dT)—Cellulose亲和层析作进一步的纯化,也可以直接作为反转录或翻译的模板.     

小麦返白系返白期间Poly(A)RNA与蛋白质水平的变化

比较了小麦返白系与其原始品种矮变1号在返白期间Poly(A)RNA与蛋白质水平的变化。在心叶变白过程中。返白系的蛋白质含量下降,随着复绿又回升;而RNA含量变化与此大致呈平行关系。在全白阶段,返白系的Poly(A)RNA含量大幅度下降。体外合成的蛋白质也少得多,但其翻译活性/Poly(A)RNA及各期的蛋白质/Poly(A)RNA比例并不比对照低。可能返白系在返白期间蛋白质水平的变化与转录水平的基因调控有关。     

采用双抗体免疫沉淀技术分离和提纯大鼠肝细胞白蛋白mRNA

采用双抗体技术和Poly(U)-Sepha-rose 亲和层析法,分离和纯化出为均一的大鼠肝细胞白蛋白mRNA。把酸乙醇—硫酸铵分部和Sephadex G-150柱层析得到均一的大鼠血清白蛋白,免疫家兔得到抗血清,上白蛋白-Sepharose 柱,得到了纯的抗白蛋白抗体。用它与肝聚核糖体一起温育,得到合成白蛋白的聚核糖体。它们之间的结合是高度专一的,似乎是通过核糖体上的初生白蛋白多肽的免疫识别作用所致。反应的免疫复合物用第二抗体追踪,然后把聚核糖体—第一抗体—第二抗体复合物,通过一个不连续的蔗糖梯度,除去未反应的聚核糖体和抗体。用苯酚—氯仿—异戊醇(50∶48∶2)从免疫沉淀中分离出白蛋白聚核糖体RNA,上poly(U)-Sepharose 柱,得到大鼠肝细胞白蛋白mRNA。所分离白蛋白mRNA,在2%聚丙烯酰胺—0.5%琼脂糖凝胶电泳时为一条带。在依赖于mRNA 的麦胚无细胞蛋白合成系统中,所有的翻译产物由第一抗体识别,第二抗体追踪,用凝胶电泳法鉴定为真正的白蛋白——约有70—80%新生白蛋白多肽与天然白蛋白一起移动。麦胚抽提物的翻译分析表明,提纯的白蛋白mRNA 的活力可高达白蛋白pRNA 的53倍。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节——Ⅴ.拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rafai)N_2-78洗涤菌丝体纤维素酶诱导形成过程中核酸代谢的变化

拟康氏木霉N_2-78洗涤菌丝体在槐糖诱导下合成纤维素酶(C_1酶、C_x酶和β-葡萄糖苷酶)的同时,RNA含量也发生有规律的变化。采用加核酸酶抑制剂和低温、快速抽提的方法,从槐糖诱导的N_2~-78洗涤菌丝体中提取总RNA,经寡聚(dT)—纤维素柱分离,得到含 Poly(A)的RNA。聚丙烯酰胺凝胶电泳和亲合层析分离证明,经槐糖诱导后,菌丝体中Poly(A)-RNA含量增加。     

用DNA过量核酸分子杂交法对大鼠肝和大鼠肝癌细胞核RNA的比较研究

用DNA过量核酸分子杂交法观察到,大鼠肝癌细胞中重复频率在10~4以上的Poly(A)-核RNA的频率和种类,均比大鼠正常肝细胞有所增加。大鼠肝癌细胞中重复频率在1—4×10~2的Poly(A)-核RNA和Poly(A)~+核RNA的重复频率,比大鼠正常肝细胞减少,而RNA种类则增加。大鼠肝癌细胞中,接近单拷贝的Poly(A)-核RNA和Poly(A)~+核RNA,其频率比大鼠正常肝细胞略有增加,而种类则减少。用总细胞核RNA得类似结果。     

牛泌乳素mRNA的分离及鉴定

本文报道了从牛脑垂体提取总RNA,经寡聚脱氧胸苷纤维素亲合层析分离获得牛脑垂体Poly(A)~+RNA。牛泌乳素mRNA经含羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳分析,估计其长度约为1200个核苷酸。根据牛泌乳素的部分氨基酸序列推断并合成寡聚核苷酸探针,经Northern印迹杂交及放射自显影分析,证实了该mRNA中含有牛泌乳素mRNA的序列。在兔网织红细胞体外翻译体系中,牛泌乳素mRNA促进了~35S-甲硫氨酸参入,翻译合成的初级翻译产物能与兔抗羊PRL抗血清发生特异性免疫沉淀反应,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影分析结果表明,牛泌乳素前体的分子量约25000。     

急性热暴露大白鼠肝脏热休克蛋白形成的研究

本研究采用人工气候室模拟自然热环境对大白鼠进行急性热暴露实验。用苯酚法提取大白鼠肝脏总RNA;用 Oligo(dT)-纤维素亲和层析柱分离出Poly(A)⁺mRNA。将各条件下的大白鼠肝脏Poly(A)⁺mRNA在麦胚无细胞体外转译系统中表达。结果证明急性热暴露大白鼠肝脏同样能生成分子量分别为71kD、90kD、98kD和 110kD的一组热休克蛋白。     

以胸腺嘧啶核苷酸钙盐为材料的Oligo(dT)-纤维素的制备

分离生物体内的mRNA是深入研究遗传信息翻译过程的首要条件,因而为分离mRNA所特需的Oligo(dT)—纤维素在核酸研究中极为重要。目前,一般在制备这种纤维素时,都采用胸腺嘧啶核苷酸铵盐或钠盐。但这两种原料不易多得,而胸腺嘧啶核     

多种功能的poly(C)-结合蛋白

细胞内的RNA一般不会单独存在,而是与各种各样的RNA结合蛋白（RBPs）绑定在一起,形成核糖核蛋白复合体（RNP complexes）影响着RNA的加工与转归. Poly(C) 结合蛋白是一类重要的RNA结合蛋白,可分为两组：hnRNP K 和PCBP1 4. 它们以序列特异的方式与核酸嘧啶富含区相结合. 这类蛋白具有共同的结构模体（motif）,即hnRNP K 同源（KH）域. KH域是与mRNA结合的结构基础,也是机体内调控系统的组成部分,可使得Poly(C) 结合蛋白参与蛋白/核酸、蛋白/蛋白之间的相互作用,范围涉及复制、转录、mRNA稳定和翻译控制过程等. 对Poly(C) 结合蛋白功能的深刻认识可使我们洞察多种疾病的病理生理过程.     

苜蓿豆血红蛋白的信使核糖核酸(mRNA)

本文叙述了分离纯化苜蓿豆血红蛋白 mRNA 和蛋白体外翻译及其检测方法,指出苜蓿豆血红蛋白的 mRNA 约占总 RNA 的1.4%,总 poly(A)~+-mRNA 的24%左右;有6、9、26S值的不同分子量的三个群体,编码豆血红蛋白的不同组分。     

正常肝信息核糖核酸的翻译和对离体肝癌细胞的逆转分化作用

正常肝信息核糖核酸是从肝聚核蛋白体抽提RNA,通过寡聚(dT)纤维素亲和层析制备。分离的正常肝mRNA在麦胚蛋白合成系统和爪蟾卵翻译系统检定,能够翻译白蛋白,由此证明是有生物学活性的。用正常肝mRNA在离体情况下对肝癌细胞进行逆转分化研究,发现:(1)小鼠正常肝mRNA能抑制小鼠腹水肝癌细胞核酸和蛋白质的合成;初步见到人的正常肝mRNA能轻度抑制人体肝癌细胞(BEL-7404)的生长。(2)相应的正常肝mRNA分别在小鼠腹水肝癌和人肝癌细胞诱导了白蛋白合成;在人体肝癌细胞内核蛋白体聚成聚核蛋白体。(3)人体肝癌细胞受刀豆凝集素(Con A)凝集的能力减弱,这种凝集特性的改变,可以维持至3次细胞传代。这些实验结果显示肝癌细胞并非固定不可改变的,在正常肝mRNA作用下能够向正常逆转分化;讨论了mRNA转化机理,认为可能是通过肝mRNA翻译的蛋白质或mRNA本身直接调节基因转录来实现的。     

日本结缕草总RNA提取和mRNA分离方法的优化

介绍了分别以日本结缕草根部、叶部、匍匐茎等为材料的总RNA提取的改良步骤,质量和浓度检测及其注意事项,并采用Promega公司的Poly ATract Systems Ⅲ(Z5300)试剂盒进行mRNA分离,尽管这一方法成熟可行,但仍存在洗脱体积较大,常需先沉淀浓缩后才能进行后续试验(如cDNA合成),在制备少量mRNA时回收率较低等问题。据此,对mRNA分离方法作了改良,介绍了mRNA分离的优化步骤,通过增加体系形成了一种更适合于日本结缕草mRNA分离的方法,从而为日本结缕草的分子生物学研究提供基础资料。结果证明所提取的总RNA和mRNA完整,质量较高,并应用到日本结缕草cD-NA文库的构建。     

实验12 cDNA文库的简易构建法

一、合成cDNA单链 1.按照实验3的操作程序,从哺乳类细胞中抽提poly(A)~+mRNA。 2.建立合成cDNA单链的反应系统:50mM Tris·HCI pH8.3(42℃时测定pH值);10mM MgCl_2;10mM DTT;4mM焦磷酸钠;1.25mM dGTP;1.25mM dATP;1.25mM TTP;0.5mM dCTP;15—20μCi α-~32P-dCTP(3000 Ci/mmol);100微克/毫升oligo(dT_12-18);150微克/毫升 Poly(A)~+mRNA;3000单位/毫升反转录酶,用水调节至最终体积为20或40微升。43℃保温30分钟。     

脂肪酸合成酶基因片段克隆以及胰岛素诱导时该酶mRNA含量的变化

采用高效的由mRNA合成cDNA的方法,我们得到了含有3.7kb的脂肪酸合成酶基因片段的克隆pFAS_(203)。它具有限制内切酶PstⅠ、BamH Ⅰ、HineⅡ、PvuⅡ、Ava Ⅰ以及Pvu Ⅰ酶切位点,与已经得到的经杂交选择的mRNA离体翻译产物鉴定的cDNA克隆pFAS_(15)有部分重叠。对饥饿的糖尿病大鼠注射胰岛素并饲以无脂食物,肝中FAS mRNA以及其前体RNA含量增加,当注射后再饲无脂食物达12小对,肝中FASmRNA及其前体RNA约为糖尿病鼠的30倍。Poly(A)~+ RNA的Northern分析表明诱导期间FASmRNA含量增加而其分子大小不变。这些结果表明胰岛素对FAS基因的转录有调节作用。胰岛素诱导后的脂肪酸合成酶活性升高是在转录水平上调节的。     

双抗体免疫沉淀法纯化牛生长激素poly(A)~+RNA的研究

我们用双抗体免疫沉淀法,从牛垂体多聚核糖体中分离出牛生长激素特异多聚核糖体,由此多聚核糖体纯化的牛生长激素Poly(A)~+RNA,可以在麦胚体外翻译系统中和兔网织红细胞体外翻译系统中促进~(14)C-亮氨酸的参入。合成的含~(14)-亮氨酸的翻译产物中有91％可以被牛生长激素抗体沉淀。用SDS-11％PAGE对翻译产物进行鉴定表明,翻译产物在25KD处呈一条放射自显影带,与报导的牛生长激素前体分子量相吻合。