慢病毒介导雌激素受体β在乳腺癌细胞中的高表达抑制上皮细胞间质转化相关基因的表达

目的：建立稳定高表达雌激素受体β（ERβ）蛋白表达的乳腺癌ZR75-1细胞株,检测其对上皮细胞间质转化（EMT）相关基因的影响。方法：将编码人ERβ的cDNA序列插入慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后收集病毒上清,感染乳腺癌ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选后获得稳定高表达含Myc标签的人ERβ的混合细胞集落,以及作为对照组整合有对照慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro的混合细胞集落,提取细胞蛋白,用Myc抗体检测Myc-ERβ融合蛋白的表达,同时检测EMT相关基因Snail、E-Cadherin、N-Cadherin的表达水平和GSK-3β的磷酸化水平。结果：建立了稳定高表达Myc-ERβ融合蛋白的乳腺癌细胞株,和对照组相比,Myc-ERβ高表达抑制EMT相关蛋白N-cadherin和Snail的表达,增强E-cadherin分子的表达,抑制GSK-3β磷酸化水平。结论：建立了Myc-ERβ高表达的乳腺癌细胞株,发现ERβ高表达抑制EMT相关分子的表达,为深入研究ERβ分子在乳腺癌中调控EMT的机制奠定了基础。     

Slug慢病毒表达载体的构建及对ZR75-1细胞上皮间质转化的影响

目的:构建锌指蛋白Slug基因的慢病毒真核表达载体,研究Slug对ZR75-1乳腺癌细胞上皮间质转化及迁移的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Slug全长编码序列,将其插入pCDH表达载体,构建pCDH-Slug真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测Slug的表达;将重组质粒包装慢病毒感染ZR75-1细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞,Western印迹和免疫荧光检测Slug对E-钙黏蛋白表达的影响,采用划痕实验检测Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中对细胞迁移的影响。结果:双酶切实验证明Slug慢病毒表达载体构建成功;Western印迹表明Slug在293T细胞内表达成功;稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞株构建成功;镜下观察发现,稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞形态变为梭形;Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中可以抑制E-钙黏蛋白的表达;划痕实验发现Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中可以促进细胞迁移。结论:构建了Slug慢病毒真核表达载体,Slug可以促进上皮间质转化,并通过调控E-钙黏蛋白表达促进细胞迁移。     

miR-19a-3p通过靶向PIK3CB参与调控雌激素受体阳性乳腺癌化疗耐药的相关研究

目的:研究miR-19a-3p在雌激素受体(ER)阳性乳腺癌化疗耐药中的作用及可能的调控机制。方法:用10μmol/L顺铂处理ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感细胞株,MTT法检测细胞活性;RNA测序分析ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感细胞株中表达差异的microRNA;实时荧光定量PCR验证miR-19a-3p在ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感株中的表达差异;合成miR-19a-3p类似物和抑制物,分别转染ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感株,检测耐药细胞株对顺铂耐药的药物作用浓度是否发生改变;通过Starbase v2.0调取TCGA数据分析预测miR-19a-3p的靶标基因及相互调控关系;实时荧光定量PCR进一步验证miR-19a-3p与靶标基因在ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感株中的表达。结果:顺铂处理后不影响ER阳性乳腺癌耐药细胞株的细胞活性;小RNA测序发现miR-19a-3p在ER阳性乳腺癌耐药细胞株中低表达,qPCR进一步确认miR-19a-3p在ER阳性乳腺癌耐药细胞株中的表达量相比于敏感株较低;miR-19a-3p过表达促进ER阳性乳腺癌耐药株的顺铂耐药作用浓度下调,而miR-19a-3p表达被抑制后会上调ER乳腺癌敏感细胞株的顺铂敏感作用浓度;通过Starbase v2.0预测表明miR-19a-3p负调控PIK3CB,qPCR及Western印迹证实miR-19a-3p过表达抑制PIK3CB的表达。结论:miR-19a-3p通过抑制PIK3CB的表达,负调控ER阳性乳腺癌化疗耐药,增强ER阳性乳腺癌细胞对顺铂化疗的敏感性。     

LRP16与 ERα相互作用增强ERα介导的转录活性

LRP16是一个雌激素（E2）通过受体α（ERα）诱导表达的靶基因,LRP16不仅促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,而且促进细胞的侵袭生长,但对LRP16作用的分子机制尚不清楚.首先,检测到LRP16表达缺陷明显削弱了MCF-7细胞对E2的反应性增殖能力;采用Northern 印迹与Western印迹法,进一步检测到抑制LRP16表达,明显损害了ERα靶基因对E2诱导上调的反应性,这些基因包括了cyclin D1, c-myc, c-fos,MTA3, pS2和维甲酸受体α基因（RARα）等;以上结果提示,LRP16参与了ERα介导的信号途径.将ERα模式启动子报告基因3×ERE-TATA-luc,ERα以及LRP16表达载体共转染MCF-7与HeLa细胞.结果发现,LRP16增强了ERα对报告基因的转录激活,并呈现对LRP16的剂量依赖性;进而采用GST-pull down以及免疫共沉淀方法证实了LRP16与ERα之间的直接相互作用,该作用不依赖于E2的存在,但可被E2增强;采用哺乳动物双杂交方法进一步证实了ERα与LRP16相互作用位点存在于A/B区的激活功能域-１（AF1）.以上结果表明,LRP16是ERα的一个共激活因子,通过相互作用,LRP16增强了ERα介导转录活性.该研究为LRP16促进ERα阳性乳腺癌细胞增殖与侵袭生长提供了合理的分子解释.     

雌激素受体α短发夹RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌干细胞的影响

目的:构建特异抑制雌激素受体α(ERα)基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,检测其对ERα的干扰效果,并探讨其对MCF7细胞中乳腺癌干细胞含量的影响。方法:以人的ERα核酸序列为靶标,根据sh RNA设计原则设计并化学合成特异的sh RNA序列,经退火处理后与p SIH-H1质粒连接,转化大肠杆菌DH5α后挑取单克隆并测序;将该克隆进行病毒包装并感染乳腺癌MCF7细胞,用嘌呤霉素进行筛选,最终得到稳定克隆;收取细胞,用Western印迹和q RT-PCR检测ERα在m RNA及蛋白水平上的变化,流式细胞术检测敲低ERα能否影响MCF7乳腺癌干细胞的含量。结果:经测序分析表明目标sh RNA序列成功插入载体,q RT-PCR检测稳定克隆,发现该sh RNA能有效抑制目的基因的m RNA转录水平,同时Western印迹检测发现内源性ERα量明显下降;流式细胞术检测发现ERα敲低的MCF7稳定克隆中雌激素诱导的乳腺癌干细胞含量上升的现象被明显抑制。结论:设计并构建的抑制ERα的sh RNA能够有效抑制ERα的表达,并下调MCF7细胞中乳腺癌干细胞的含量,为研究ERα在乳腺癌干细胞中的功能及机制奠定了实验基础。     

人EYA3基因真核表达载体的构建及其活性检测

目的：构建带myc标签的人EYA3基因真核表达载体,获得myc-EYA3融合表达蛋白,并对其功能进行初步检测。方法：采用PCR技术从乳腺文库中扩增人EYA3基因,并将其正确插入pXJ-40-myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞系ZR75-1后,Western印迹检测表达情况,并进行生长曲线实验。结果：双酶切和测序鉴定表明,myc-EYA3真核表达质粒构建成功,转染ZR75-1细胞后成功表达;生长曲线实验结果表明,EYA3可促进乳腺癌细胞的生长。结论：构建了带myc标签的人EYA3基因真核表达载体,myc-EYA3能在乳腺癌细胞ZR75-1中表达,且能促进该细胞的生长,本实验为进一步研究EYA3在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。     

人转录因子激活蛋白TFAP_2γ促进乳腺癌细胞生长

目的:构建带Flag标签的人转录因子激活蛋白2γ(TFAP_2γ)基因真核表达载体,获得Flag-TFAP_2γ蛋白,检测其对乳腺癌细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从乳腺文库中扩增出人TFAP_2γ基因,并将其正确插入Flag载体;将重组质粒与空载体转染人乳腺癌细胞系ZR75-1和MCF-7细胞后,Western印迹检测表达情况,并进行生长曲线实验。结果:双酶切和测序鉴定表明,Flag-TFAP_2γ真核表达质粒构建成功,转染ZR75-1和MCF-7细胞后获得表达;生长曲线实验结果表明,TFAP_2γ可促进乳腺癌细胞的生长。结论:构建了带Flag标签的人TFAP_2γ基因真核表达载体,并能在乳腺癌细胞ZR75-1和MCF-7中表达,且能促进细胞的生长。本实验为进一步研究TFAP_2γ在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

PES1基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞的生长抑制

目的:构建PES1基因的慢病毒干扰载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-30生长的影响。方法:设计针对PES1基因的siRNA引物,克隆到pSIH1-H1-Puro载体,包装成慢病毒,测定病毒的滴度,感染人乳腺癌细胞ZR75-30,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低PES1对ZR75-30细胞生长的影响。结果和结论:构建了具有明显干扰效果的PES1基因的siRNA慢病毒载体,能够有效抑制ZR75-30细胞内源的PES1 mRNA和蛋白水平,敲低PES1能够抑制ZR75-30细胞的生长。     

人FOXO3a基因真核表达载体的构建及其功能验证

目的:构建带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,并对其功能进行初步检测。方法:采用PCR技术,从乳腺文库中扩增人FOXO3a基因,并将其正确插入pXJ-40-myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞系ZR75-1、MCF-7后,通过Western印迹检测其表达情况,并用CCK8法测定细胞生长曲线。结果:双酶切和测序鉴定表明myc-FOXO3a真核表达质粒构建成功,转染乳腺癌ZR75-1、MCF-7细胞后目的基因成功表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-FOXO3a的乳腺癌细胞较空载体细胞生长较慢。结论:构建了带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,为进一步研究FOXO3a在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

LRP16对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

用Northern印迹方法检测雌二醇 (17β E2 )对LRP16mRNA表达的时间及剂量依赖性调控作用 .构建LRP16基因启动子序列调控的萤光素酶报告子 (pS0 ) ,并与雌激素受体α和 β(ERα和ERβ)表达载体共转染COS 7和MCF 7细胞后测定萤光素酶活性 .将LRP16基因的表达载体转染MCF 7细胞 ,测定过表达LRP16对细胞的生长特性的影响 .17β E2 使MCF 7细胞中LRP16mRNA表达水平增加 ,增加幅度未显示出 17β E2 培养时间和剂量的依赖性 .pS0 与ERα表达载体共转染细胞的相对萤光素酶活性较非共转染组 (对照组 )及pS0 ERβ表载体共转染组升高 5～ 10倍 .LRP16基因过表达促进MCF 7细胞的增殖 .研究表明 ,雌激素可能通过ERα上调乳腺癌MCF 7细胞LRP16基因的表达并促进细胞增殖     

LRP16通过调控E-钙粘合素的表达促进MCF-7细胞的侵袭生长

LRP16在原代乳腺癌组织中表达水平与雌激素受体α（ERα）表达状态以及腋窝淋巴结侵袭数目密切相关.为研究LRP16基因对乳腺癌MCF-7细胞侵袭生长的影响,并探讨涉及的分子机制,采用基质胶黏附实验与Transwell方法,检测内源性LRP16表达抑制MCF-7细胞的体外黏附、侵袭生长与迁移特征.结果表明,抑制LRP16在MCF-7细胞中的表达,降低了细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力;采用FVB小鼠进行的实验性转移试验结果显示,抑制LRP16显著降低了MCF-7细胞的肺转移结节数目;为探索可能的分子机制,采用Western印迹方法,检测了LRP16对乳腺癌转移相关分子MMP-2, MMP-9, CD44和E-钙黏着蛋白表达的影响,结果在LRP16抑制的MCF-7细胞中只有E-钙黏着蛋白蛋白表达上调.进一步的Northern印迹与免疫组化实验结果表明,抑制LRP16可上调MCF-7细胞中E 钙黏着蛋白基因的mRNA与蛋白表达水平;共转染与双荧光素酶方法检测LRP16对E-钙黏着蛋白基因启动子的表达调控效应,结果显示,LRP16抑制E 钙黏着蛋白基因基因5′-近端启动子的转录激活,该抑制效应选择性存在于内源性ERα阳性细胞,并且依赖于雌激素的存在;染色质免疫共沉淀方法（ChIP）检测ERα与E-钙黏着蛋白基因启动子的相互作用,结果显示,在LRP16基因表达缺陷的MCF-7细胞中,ERα抗体沉淀到E-钙黏着蛋白基因启动子的DNA序列;上述研究结果表明,抑制LRP16基因表达,削弱了激素依赖型乳腺癌细胞的侵袭生长能力,其分子机制涉及了LRP16通过ERα介导对E-钙黏着蛋白基因基因转录激活的调控.     

探究靶向FTO下调的miRNA及其对乳腺癌细胞生物学行为的调节

该文筛选了靶向抑制FTO的miRNA并探究其乳腺癌细胞生物学行为的影响。通过生物信息学的方法筛选出了影响乳腺癌患者生存的m6A去甲基化酶FTO后,再通过CCK-8实验验证了FTO的下调能够抑制乳腺癌细胞的增殖,随后预测出靶向FTO的miRNA—miR-504-5p,RT-qPCR和Western blot实验检测了乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中miRNA-504-5p对FTO表达水平的影响,双荧光素酶报告基因实验验证了miRNA-504-5p与FTO的结合关系,采用CCK-8、Transwell小室实验、流式细胞术等探究了miRNA-504-5p mimic(类似物)通过调控FTO对乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响。实验结果表明,低表达FTO的乳腺癌患者相较于高表达FTO的乳腺癌患者具有更高的生存概率,miRNA-504-5p作为潜在的靶向FTO的miRNA,能够在mRNA与蛋白水平抑制FTO的表达,并且miR-504-5p在FTO 3'-UTR的5 927–5 933位点处与FTO靶向结合,miR-504-5p能通过下调FTO抑制乳腺癌细胞的增殖与迁移并促进乳腺癌细胞的凋亡,使细胞阻滞在G_0/G_1期。综上所述,该研究发现了miR-504-5p能下调FTO的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖与迁移,促进乳腺癌细胞的凋亡,使乳腺癌细胞的细胞周期阻滞。这可以为乳腺癌的分子机制探究与治疗提供潜在的参考价值。     

Twist1稳定表达细胞株的建立及对乳腺癌细胞上皮-间充质转变的影响

目的:构建Twist1的慢病毒真核表达载体,并建立稳定表达Twist1的乳腺癌细胞株,研究Twist1在乳腺癌中对上皮-间充质转变(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Twist1编码序列,克隆到慢病毒p CDH载体,构建成p CDH-Twist1,转染293T细胞,Western印迹鉴定p CDH载体介导的Twist1的表达;包装病毒载体,感染ZR75-1细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响。结果:经Bam HⅠ、Eco RⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Twist1表达载体,Western印迹实验发现Twist1在293T细胞内表达;嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的ZR75-1细胞株。结论:构建了p CDH-Twist1的真核表达载体并建立了稳定表达Twist1的ZR75-1细胞,为进一步研究Twist1在EMT过程中的机制奠定了基础。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建带myc标签的Six1基因的真核表达载体,获得myc-Six1融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Six1编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果:双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT-PCR结果表明myc-Six1可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论:构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的Sixl基因的真核表达载体,获得myc-Sixl融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Sixl编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,West-ern印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒-9空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT—PCR结果表明myc-Sixl可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论：构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

人KAT7基因促进雌激素受体α表达

目的:构建带有Myc标签的赖氨酸乙酰基转移酶(KAT7)的真核表达载体,获得Myc-KAT7融合蛋白,并检测其对雌激素受体α(ERα)表达的影响。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术从中扩增出人KAT7基因的编码序列,插入p XJ-40-Myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,并提取总RNA采用q RT-PCR检测ERα的表达。结果:双酶切和测序结果表明Myc-KAT7真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后Western印迹鉴定表明融合蛋白得到表达,q RT-PCR表明KAT7在转录水平能够促进ERα表达。结论:构建了带Myc标签的人KAT7真核表达载体,并发现KAT7对ERα的表达具有促进作用。     

乳腺癌中雌激素受体α表达水平调节的分子机制

雌激素受体α(ERα)在乳腺癌的发生发展中扮演重要角色,因而ERα成为乳腺癌治疗的分子靶标。ERα的表达水平在乳腺癌患者中差异较大,即使同一患者,在乳腺癌的不同阶段也可能有很大的差别。乳腺癌内分泌治疗的疗效以及预后都与ERα表达水平密切相关。影响ERα表达水平的分子机制复杂,众多调节分子在染色质、转录、转录后、翻译和翻译后等水平参与ERα表达水平的调节。在染色质和转录水平,许多分子通过直接或间接地与ERα启动子的相互作用改变ERα的转录;在转录后/翻译水平,一些microRNA通过诱导ERαmRNA的降解和/或抑制其翻译降低ERα的水平;在翻译后水平,许多分子通过泛素-蛋白酶体途径调节ERα蛋白水平。文章从不同水平,对这些调节分子的调节机制进行简要综述。     

miR-5688在三阴性乳腺癌细胞中下调固醇调节元件结合蛋白1的表达而抑制三阴性乳腺癌细胞增殖

目的:探讨miR-5688在患者来源三阴性乳腺癌(PD-TNBC)细胞中通过抑制固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)的表达从而发挥抗肿瘤活性。方法:查询miRDB数据库,预测潜在作用于SREBP-1的miRNA;qPCR实验检测三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系、PD-TNBC细胞及患者组织中SREBP-1与miR-5688的表达;Western印迹验证miR-5688下调SREBP-1的表达;构建miRNA-5688的过表达慢病毒颗粒,在上述细胞中过表达miR-5688,以MTT实验、Transwell实验、裸鼠皮下成瘤实验检测miRNA-5688对细胞增殖、转移与侵袭作用、裸鼠成瘤的影响。结果:在三阴性乳腺癌临床标本中,miR-5688与SREBP-1的表达呈负相关趋势,通过在PD-TNBC细胞中验证,miR-5688能够下调SREBP-1的表达;转染miR-5688抑制剂能够阻断miR-5688抑制SREBP-1表达的作用。体外细胞实验结果显示miR-5688能够抑制MDA-MB-231细胞系和PD-TNBC细胞的增殖、转移与侵袭作用,同样转染miR-5688抑制剂能够阻断其抑制作用。体内小鼠成瘤实验结果显示,miR-5688能够抑制PD-TNBC细胞在裸鼠皮下的成瘤作用。结论:miR-5688能够在PD-TNBC细胞中下调SREBP-1的表达,并抑制三阴性乳腺癌细胞增殖作用。     

雌激素受体α真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体α（ERα）高效真核表达载体,并检测其转录活性。方法：用常规PCR方法特异扩增带有Flag标签的人ERα全长编码序列,经双酶切后将其克隆到真核表达载体pIRESpuro2中,构建重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERα;用Westernblot鉴定该重组质粒介导的Flag-ERα在人胚肾细胞株293T中的表达情况;用含雌激素应答元件的报告基因系统检测ERα的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERα重组质粒,该质粒介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含雌激素应答元件的报告基因的活性。结论：ERα高效真核表达载体的构建为进一步研究ERα在乳腺癌中的作用奠定了基础。