急性弛缓性麻痹病例中Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒变异株基因特征分析

研究Ⅱ型脊髓灰质炎(脊灰)疫苗变异株的基因特征,为我国使用口服脊灰减毒活疫苗/脊灰灭活疫苗使用策略,维持无脊灰状态和全球最终消灭脊灰提供科学依据。根据型内鉴定的检测结果,从2000~2001年AFP病例分离到的Ⅱ型脊灰疫苗变异株中选取有聚集性的5株病毒进行全基因组序列测定(贵州省3株、山东省2株),并进行核苷酸、氨基酸同源性分析。贵州省3株病毒全基因组序列完全一致,但与SabinⅢ型病毒发生重组,重组区域在3A区(nt5343~5353);与疫苗株相比,Ⅱ型区域变异10个碱基,其中VP1区变异4个,与SabinⅡ型株核苷酸同源性为99·56%,氨基酸同源性99·34%;Ⅲ型区域变异9个碱基。山东省2株病毒全基因序列共享16个突变位点,没有发生重组,与SabinⅡ型株相比,VP1区分别变异7个和4个碱基,核苷酸同源性分别为99·22%和99·56%,氨基酸同源性分别为99·0%和99·67%。上述5株病毒在重要的减毒位点nt481、nt2909均发生突变。此研究中5株病毒分属于两个不同的传播链,但是共享nt481、nt2909、nt2992三个突变位点,这3个突变位点不在重组区域内,他们的共同作用可能是影响病毒传播力的重要因素,但目前尚无证据证明脊灰疫苗病毒型间重组会增加病毒的毒力及传播力。     

急性弛缓性麻痹聚集病例病原毒力和分子特征分析

为探索脊灰病毒型内重组、位点突变等分子特征与神经毒力的关系,对2002年6月四川省攀枝花地区发生的急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)聚集病例的分离病毒株进行了转基因小鼠(PVR-Tg21 mice)神经毒力实验和全基因组核苷酸序列测定。结果显示:所测4株分离病毒(均为Ⅱ型脊灰病毒)神经毒力没有明显升高。4株病毒基因全长都是7 439bp,编码区翻译的氨基酸全长2 207aa。4株病毒的VP1区核苷酸序列完全相同。6208和6235c两株病毒是由Ⅱ型和Ⅲ型脊灰病毒在3A区重组而来,6209和6236两株病毒是由Ⅱ型和Ⅰ型脊灰病毒在2C区重组而来。4株病毒在5'非编码区nt481和VP1区的nt2 909两个强减毒位点都发生回复突变,6209和6236两株病毒重组的SabinⅠ的重要减毒位点nt6 203亦发生回复突变。结合神经毒力实验和序列分析结果可以确定脊灰病毒的型别间的重组与神经毒力没有直接关系,同时可以推论SabinⅢ的nt5 832,SabinⅡ的nt1 450和nt2 386这3个位点可能是毒力相关位点。     

一起无菌性脑膜炎疫情中埃可病毒30型的全基因组分析

对引起一起无菌性脑膜炎的埃可病毒30型（（Echovirus 30,E30）毒株进行全基因组测序,并分析其遗传变异和分子进化特征。提取病毒RNA,荧光RT-PCR确定为肠道病毒,再扩增其VP1区,测序确定为E30,设计针对E30全基因组的引物,RT-PCR扩增和序列测定获得全基因序列。利用DNAMAN 9.0、MEGA X、RDP 5和SimPlot 3.5.1软件分析全基因序列。E30无锡株基因组全长7 425 bp个核苷酸（nt）,5′端和3′端分别为743 nt和97 nt的UTR,二个UTR之间为一个6 585 nt长的开放阅读框,编码一个含2 195个氨基酸（aa）的多聚蛋白。与GenBank中基因组序列比对,最同源的是毒株USA/2017/CA-RGDS-1048 （基因登录号：MN153801）,核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为99.1%。VP1基因进化树分析显示,E30无锡株属于h型,并可归类于h型下分的基因簇GroupⅣ。种系进化分析和同源性分析提示E30无锡株可上溯到中国江苏毒株FDJS03毒株。分析还发现E30无锡株在非结构区存在重组,重组序列可能来自E3...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株基因组序列测定和分析

应用RT-PCR方法分段扩增出PRRSV上海分离株S1毒株的4条基因大片段,扩增后的产物分别克隆于pCR-XL-TOPO载体鉴定后测序,同时应用RACE方法对S1毒株的3'和5'基因末端进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV S1株全基因组cDNA序列.测序结果表明PRRSV S1株基因组全长15441 bp,包含9个开放式阅读框,5'UTR含有189nt,3'端UTR含有181nt,其中包含30nt Poly (A).基因组序列分析结果显示该病毒与ATCC VR-2332和BJ-4分离株的核苷酸同源性分别99.5%和99.6%.与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8%.     

我国登革 4型病毒 B5株基因组全序列的测定及分析(英文)

 对我国登革 4型病毒 B5株 (D4- B5)基因组进行全序列测定及分析 ,为研究病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革疫苗奠定基础 .根据登革 4型病毒 81 4669株的序列设计特异引物 ,通过 RT- PCR扩增出 D4- B5株不同长度的片段 ,分别克隆到 p GEM- T载体 ,将挑取的阳性克隆进行 PCR、酶切鉴定及序列测定 .结果显示 ,D4- B5株的基因组全长 1 0 665nt,5′和 3′非编码区分别为 1 0 1 nt和 40 3nt,中间一个长 1 0 1 61 nt的开放读码框架 ,编码 3387个氨基酸 .与 D4- 81 4669株比较 ,两者核苷酸序列同源性为 93.0 8% ,氨基酸序列同源性为 96.58% .D4- B5株的基因组全序列与 D4- 81 4669株类似 ,但也有较大差异 .同源进化分析表明 ,D4- B5株的基因型为 型 ,与登革 4型病毒菲律宾分离株亲缘关系较近 .这是首次报道的我国登革 4型病毒分离株基因组全序列 ,对研究病毒基因组结构与功能的关系 ,探讨我国毒株的地理来源及研制适合我国人群的新型登革疫苗具有一定的意义 .     

我国2009年新分离乙脑病毒全基因组序列特征研究

本研究对我国2009年新分离的两株乙脑病毒进行全基因组序列测定和分析,以了解病毒全基因组分子特征。通过RT-PCR和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用ClustalX、DNASTAR、MEGA等生物学软件完成核苷酸序列及氨基酸序列分析和系统进化分析等。研究结果显示,新分离两株乙脑病毒YN0911和YN0967株基因组全长均为10 965个核苷酸,编码3 432个氨基酸。这2株乙脑病毒之间核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.8%。与国际乙脑病毒流行株相比,核苷酸同源性为83.5%～98.9%,氨基酸同源性为94.8%～99.7%。与乙脑病毒疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白有13个氨基酸差异位点,但都位于抗原关键位点之外。这2株病毒在3′UTR区域存在11nt缺失。基于C/PrM区段、E基因、全基因组系统进化分析结果均显示新分离2株乙脑病毒为G I乙脑病毒,并且和越南、四川、贵州、广西以往的分离株遗传进化关系较近。本研究提示我国新分离的2株乙脑病毒均为G I乙脑病毒,决定病毒毒力的关键氨基酸位点未见明显变化。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株基因组序列测定和分析

应用RT-PCR方法分段扩增出PRRSV上海分离株S1毒株的4条基因大片段,扩增后的产物分别克隆于pCR-XL-TOPO载体鉴定后测序,同时应用RACE方法对S1毒株的3′和5′基因末端进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSVS1株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSVS1株基因组全长15441bp,包含9个开放式阅读框,5′UTR含有189nt,3′端UTR含有181nt,其中包含30ntPoly(A)。基因组序列分析结果显示该病毒与ATCCVR-2332和BJ-4分离株的核苷酸同源性分别99.5%和99.6%。与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8%。     

陕西省9株乙脑病毒的分离及E基因序列分析

分析陕西省分离的9株乙脑病毒基因组序列特征。使用乙脑病毒全基因组序列测定引物进行RT-PCR扩增,扩增产物进行测序,拼接后获得基因组序列。利用MEGA 4.1、MegAlin、MEGA7.0等软件进行毒株的系统进化分析,并与P3株、减毒活疫苗SA14-14-2株及覆盖5个基因型别的其他乙脑病毒进行E基因序列比对。9株分离株3株分离自猪舍、6株分离自羊舍,其中4株获得全基因组序列,5株测得E基因序列。基于E基因序列进行毒株核苷酸、氨基酸同源性比较,结果显示分离株均与基因I型GI-b亚型毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性范围为96.5%～99.7%、氨基酸同源性范围99.2%～100.0%;与SA14-14-2株核苷酸同源性范围为87.5%～88.9%、氨基酸同源性范围96.3%～97.2%;与P3株核苷酸同源性范围为87.6%～88.1%、氨基酸同源性范围96.7%～97.6%。分析09年（陕南地区）分离株与18年（关中地区）分离株的E基因核苷酸差异率为1.8%～2.9%、氨基酸差异率为0%～0.8%。陕西省自然界中循环的乙脑病毒以基因Ⅰ型为主,与P3株在抗原毒力关键位点无差异,...     

猪瘟弱毒C81株全基因组测序及分子结构预测

参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列(GenBankAY663656).C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白.序列分析表明,C81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84.4%～99.6%和91.6%～99.4%.同时,我们绘制了26株CSFV ORF的进化树,比较了CSFV 5'非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测.     

中国狂犬病疫苗生产株CTN-1全基因序列分析

本文首次对我国现行狂犬病疫苗生产用毒株CTN-1进行全长基因组序列测定和分析,为CTN-1疫苗在我国实际应用中的优势提供理论基础。利用RT-PCR方法分段扩增CTN-1全基因组序列,随后将PCR产物克隆到T载体、测序、拼接,用MegAlign软件比较CTN-1全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组序列的同源性;再以糖蛋白(G)基因为模板,用ClustalX和MEGA4软件进行系统进化分析。测序结果表明CTN-1全基因组序列的长度为11925nt(GenBank登录号FJ959397),序列分析表明CTN-1为基因Ⅰ型;CTN-1株全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组之间的同源性是81.5%～93.4%;与美国蝙蝠分离株SHBRV18的同源性最低,仅为81.5%;与新近从中国国内分离的野毒株HN10株的同源性最高,达93.4%。系统进化分析结果表明,CTN-1与国内不同地区大多数分离的狂犬病街毒株聚类于同一组内;而我国另一疫苗株aG株与国外疫苗株如Flury、PM、PV、ERA、RC-HL和个别中国街毒株分在另一组内。G基因氨基酸对比也显示CTN-1株与国内大多数街毒株的同源性高于其他疫苗株,结果说明CTN-1株较其他疫苗株病毒更适合制备用于预防中国狂犬病的灭活疫苗。     

猪瘟弱毒C81株全基因组测序及分子结构预测

参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列(GenBank:AY663656)。C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白。序列分析表明,C81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84.4%~99.6%和91.6%~99.4%。同时,我们绘制了26株CSFVORF的进化树,比较了CSFV5'非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测。     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒(CPV).提取病毒基因组DNA,并以此DNA为模板,采用人工合成的引物进行PCR 扩增,PCR产物经BamHI、SacI双酶切后,克隆于pUC19质粒的BamHI/Sac I位点.重组质粒pUCVP2经PCR鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明:获得了犬细小病毒内蒙株(CPV-IM)VP2基因的全长克隆, VP2基因全长1755nt,与国外报道的美国1株(CPV-N)、美国2株(CPV-B)和猫全白细胞减少症病毒(FPLV)的核苷酸序列同源性分别为99.32%、98.29%、98.52%,氨基酸序列同源性分别为98.87%、97.09%、97.77%.     

乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2全基因组序列测定及基因遗传稳定性

目的对乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株进行全基因组序列测定和分析,并观察该生产株在疫苗制备过程中的基因遗传稳定性。方法根据DNA序列数据库(Gen Bank)公布的SA14-14-2株的序列,设计合成7对引物,提取疫苗生产株SA14-14-2及其工作种子批生产的3批原液、3批成品疫苗的病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SA14-14-2株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至大肠埃希菌DH5α中,挑取阳性菌落克隆、鉴定后测定全序列并对序列进行比较分析,观察毒株在传代的过程中病毒滴度的稳定性。结果乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株基因组全长10 976 bp,编码3 433个氨基酸。3批原液和3批成品疫苗的基因组全长为10 977 bp,比较分析发现,在3'端非编码区10 701处多一个G核苷酸的插入。与DNA序列数据库(Genbank)登录号为D90195的全长序列同源性分别是99.9%、99.9%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%、99.8%,其中E蛋白的同源性均为100%。SA14-14-2生产株的病毒滴度为7.22 lg PFU/mL,原液和成品疫苗的滴度分别为7.32、7.23、7.32、6.86、6.92、6.70 lg PFU/mL。结论乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2基因稳定,具有良好的一致性,为乙型脑炎减毒活疫苗的质量的稳定性提供了可靠依据。     

致胰腺泛黄鸭1型甲肝病毒全基因组分子特征

【目的】揭示致胰腺泛黄鸭1型甲肝病毒(duck hepatitis A virus 1,DHAV-1)全基因组的分子特征。【方法】运用RT-PCR技术,扩增出致胰腺泛黄DHAV-1 MPZJ1206株全基因组序列,并与鸭甲肝病毒参考毒株基因组序列进行比对分析。【结果】致胰腺泛黄DHAV-1 MPZJ1206株基因组全长为7703 nt,(G+C)%为43.05%,包含一个大的开放阅读框,编码2249个氨基酸残基的多聚蛋白,基因组结构与其他DHAV-1参考毒株一致。序列比对结果显示,MPZJ1206株全基因组序列与GenBank数据库中DHAV-1参考毒株核苷酸序列同源性在93.5%-99.6%之间,氨基酸同源性在97.9%-99.6%之间,遗传距离均低于7%;分子系统进化分析显示与2011年分离的2株DHAV-1(Du/CH/LGD/111238和Du/CH/LGD/111239)亲缘关系最近。【结论】尽管MPZJ1206毒株感染雏番鸭引起的临床病变与传统DHAV-1差异明显,但其基因组分子特征与传统的DHAV-1毒株相似,病毒致病型的改变可能与其组织嗜性改变相关。     

狂犬病病毒aG株全基因组序列测定及遗传稳定性分析

目的探究狂犬病病毒(Rabies virus,RV)aG株全基因组序列特征及遗传稳定性。方法严格按疫苗生产工艺进行传代,提取主种子批、工作种子批及疫苗原液病毒RNA,通过RT-PCR技术扩增全基因组各片段基因,然后分别将其克隆到p GEM-T载体中,并进行序列测定;采用DNAStar软件包对aG株与Gen Bank中4aGV参考株(JN234411)以及18株基因1型RV参考株进行同源性分析。结果 aG株全基因组由11 925个核苷酸组成,共编码3 600个氨基酸。疫苗原液与主种子批全基因组核苷酸和氨基酸同源性均为100%,而工作种子批与主种子批的核苷酸与氨基酸同源性分别为99.97%和99.92%;aG株与4aGV参考株全基因组核苷酸与推导的氨基酸同源性均为99.9%,其与18株基因1型参考株核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.2%~97.6%和93.7%~98.3%;aG株传代病毒与4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守,且各主要功能区未发生变异。结论狂犬病病毒aG株在实验室长期生产传代过程中,全基因组遗传特性稳定。     

2010年山东省环境污水中脊髓灰质炎病毒的监测及其基因特征分析

本研究在山东省开展了脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)的外环境监测,从济南、临沂两地采集污水标本,浓缩处理后进行病毒分离,对分离到的PV采用中和试验进行血清定型,并对其VP1及3D区进行序列测定,分析其基因突变和重组情况。2010年,共采集污水标本32份,PV阳性10份,阳性率31.3%;分离到18株PV(PV1型3株,PV2型9株,PV3型6株),均为疫苗相关株,VP1完整编码区核苷酸变异数在0~4个之间,在3株PV2型病毒和4株PV3型病毒的基因组中发现重组;对VP1区影响神经毒力的减毒位点分析发现,PV1型病毒中有1株在nt 2 749发生突变(A→G),PV2型病毒中有1株在nt2 908发生A→G突变,3株在nt2 909发生U→C突变,6株PV3型病毒全部在nt2 493发生C→U突变。环境污水中可以分离到PV,其基因重组率和主要减毒位点的回复突变率较高,未发现脊灰野毒株和疫苗衍生株脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus,VDPV)。     

三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR方法获取了3株广西地方强毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因组序列,并对其进行了比较分析。此3株病毒的全基因组序列均由15192个碱基组成,与GenBank公布的ZJ1、U.S/Largo/71、Italy/2736/00等7个毒株的全基因组序列长度相同,比LaSota、Clone-30和B1的全基因组序列多出6个核苷酸,此6个核苷酸位于np基因的非编码区内,相对与NDV毒株LaSota、Clone-30和B1序列的1647~1648nt位。通过序列的比较分析,发现GX7/02、GX9/03和GX11/03与ZJ1毒株的同源性较高,而与LaSota、Clone-30和B1等毒株的同源性较低。     

三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了8对引物,运用RT-PCR 方法获取了3株广西地方强毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03的全基因组序列,并对其进行了比较分析.此3株病毒的全基因组序列均由15192个碱基组成,与GenBank公布的ZJ1、U.S/Largo/71、Italy/2736/00等7个毒株的全基因组序列长度相同,比LaSota、Clone-30和B1的全基因组序列多出6个核苷酸,此6个核苷酸位于np基因的非编码区内,相对与NDV毒株LaSota、Clone-30和B1序列的1647～1648nt 位.通过序列的比较分析,发现GX7/02、GX9/03和GX11/03与ZJ1毒株的同源性较高,而与LaSota、Clone-30和B1等毒株的同源性较低.     

四株不同宿主来源的Class I基因3型新城疫病毒全基因组序列测定及比较分析

为了解析基因型相同但宿主来源不同的新城疫病毒的全基因组差异。本文采用RT-PCR方法分别获得4株（JS/3/09/Ch,ZJ/3/10/Ch,AH/2/10/Du,JS/9/08/Go）Class I 基因3型病毒的全基因组核苷酸序列,并与GenBank中已公布的Class I基因3型病毒全基因组序列进行比对分析。本实验4株病毒的基因组长度均为15198bp,在基因组1607～1608位有6碱基的缺失,在2381～2382位有12碱基的插入,裂解位点为112EQ/RQE/GRL117是标准弱毒特征。5株Class I基因3型病毒之间全基因组同源性超过93%;而与Class II弱毒株同源性最低只有72.2%;比较6个结构蛋白基因的同源性,NP基因的同源性最高(98.3%～96.4%),而P基因最低(96.1%～91.9%)。结果表明不同宿主来源的Class I基因3型新城疫病毒在遗传信息方面差异不大,但NP/F/L基因的变异幅度较P/M/HN基因明显。