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人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法 总被引:1,自引:1,他引:0
目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。 相似文献
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转豇豆胰蛋白酶CPTI基因棉花检测用标准分子的制备 总被引:1,自引:0,他引:1
利用PCR的方法克隆豇豆胰蛋白酶基因CPTI、基因表达调控元件35S启动子、NOS终止子以及棉花内标基因Sad1,连接到克隆载体上,构建成质粒标准分子pGB。PCR检测过程中,质粒标准分子和转基因棉花中能扩增出4个目的条带,而非转基因棉花中不能扩增出相应的条带,证明构建好的质粒标准分子能用于转基因棉花的定性检测。荧光定量PCR绘制4个目的基因片段的标准曲线,各标准曲线的相关系数均达到0.985以上,说明建立的PCR具有很好的Ct值-初始浓度相关性,达到定量分析的需求,而且荧光定量PCR反应具有很好的重复性和稳定性,可用于实际样品的定量检测。 相似文献
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雄牛特异的SRY同源序列的扩增和分析 总被引:6,自引:0,他引:6
利用人、兔、鼠SRY序列设计引物,应用PCR扩增牛的SRY序列,获得200bp的雄牛特异的扩增片段。克隆该扩增片段,获得重组质粒pCH21,进行序列分析,并与人、兔和鼠SRY的对应区域比较,具有高度同源性。用pCH21 DNA作探针与牛的基因组DNA酶切图谱杂交,显示了雄牛特异的I.7kb的杂交带。分析200bp的PCR扩增片段是牛的SRY基因片段。用同一对引物扩增人和山羊的DNA样品,也获得雄性特异的200bp的扩增片段。 相似文献
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构建SARS冠状病毒S基因序列克隆p-SARS-S,作为自行设计、建立的RT-PCR检测方法的阳性对照,并为该基因的表达奠定基础.设计合成了位于病毒基因21 504~22 136位的长633 bp的序列片断作为模板进行PCR扩增;将PCR产物与T-Easy载体连接,经过转化提取重组质粒DNA.对构建的阳性克隆进行PCR、酶切、测序鉴定.对经EcoRⅠ酶切鉴定为阳性的重组表达质粒测序,结果显示插入片段大小、方向、碱基匹配与预期一致.构建的阳性对照克隆p-SARS-S有助于建立严格的SARS病毒基因室内质控措施. 相似文献
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肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的PCR法鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
肺炎链球菌是一种致病率和致死率很高的病原菌 ,若无丰富临床检测经验从临床标准中分离鉴定此菌较困难 ,本实验以寡核苷酸引物YH1 YH2、YH7 YH8分别扩增肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,通过改变各种反应条件 ,建立了这两种病原因子基因的PCR检测方法。用此方法对 2 0株肺炎链球菌标准菌株及 7株对照菌株进行了鉴定 ;其扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和和AccI进行酶切以确认扩增产物是否正确 ;用酚 氯仿抽提纯化的全细胞DNA对PCR方法的检测灵敏度进行了测定 ;并利用此方法对 2 8份临床标本分离物进行了鉴定。结果 所有 2 0株肺炎链球菌均可分别用引物YH1 YH2、YH7 YH8扩增出 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,而对照菌株均呈阴性 ;自溶素及溶血素基因的扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和AccI消化后产生的片段和预期的完全一致 ;两对产物均可从 10fg的全细胞DNA中扩增出目的DNA片段。所建立的两套PCR系统对 2 8份临床标本分离物进行鉴定 ,其中PCR阳性的 15份分离物经生化学特性检查被鉴定为肺炎链球菌。本试验所建立的两套PCR检测系统具有特异性强 ,灵敏度高及操作简单等优点 ,均可用于肺炎链球菌的鉴定。 相似文献
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以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了siRNA表达体系。利用农杆菌介导法将带有pBIKSTI3的菌株转化大豆,从2棵再生植株中得到2 100bp的特异性扩增条带,而未转化的植株中无该片段的产生。 相似文献