轮状病毒VP7基因的克隆与表达

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-T simple载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定DNA全序列。结果显示,克隆片段全长为981 bp。将轮状病毒VP7基因定向的克隆到原核表达载体pET-32a启动子下游,构建原核表达载体pET-32aVP7。将质粒pET-32aVP7转化Transetta表达菌株进行诱导表达,裂解菌体细胞抽提蛋白质进行SDS-PAGE。结果表明,轮状病毒壳蛋白VP7基因在Transetta表达菌株内得到成功表达。     

盐藻小G蛋白DsRab的原核表达及纯化

前期对盐藻小G蛋白基因DsRab研究表明,在盐胁迫诱导下该基因转录水平明显提高。为进一步研究该蛋白在盐藻耐盐机制中的作用,PCR扩增DsRab的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体pGS-21a,得到重组表达载体pGS-21a-DsRab。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并优化诱导表达条件,利用GST-SefinoseTM Kit进行纯化,用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,成功构建了重组表达载体pGS-21a-DsRab,SDS-PAGE结果显示得到的蛋白与预期分子量相符,并且纯度较高;Western blot检测结果初步证明该融合蛋白为GST-DsRab。     

胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因新型真核表达载体的构建及其在盐藻中的表达

应用PCR技术扩增Nos基因、 CaMV35S 启动子片段和氯霉素抗性基因 Cat ,并与胰蛋白酶抑制剂 KSTI3 基因连接,构建真核表达载体pMDCKN-Cat。DNA序列分析结果表明:表达载体中的胰蛋白酶抑制剂 KSTI3 基因、启动子 CaMV35S 、终止子 Nos 和氯霉素抗性基因 Cat 与已知序列完全一致。采用LiAc/PEG介导法将质粒pMDCKN-Cat转化至盐藻细胞中,通过氯霉素抗性基因筛选和PCR鉴定获得转基因盐藻细胞。经Western blotting检测,在硝酸纤维素膜上出现清晰的条带,分子量为20.1kDa,证明胰蛋白酶抑制剂 KSTI3 基因在盐藻中得到成功表达。     

应用RNA干扰技术降低玉米支链淀粉含量

为了调控玉米淀粉的生物合成过程,克隆了玉米淀粉分支酶(starch branching enzymes,SBE)基因,构建高效的siRNA表达体系,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系.PCR扩增和Southern杂交结果证明,目的基因已被整合到基因组中,且能够遗传.Northern杂交分析表明,该目的基因在转基因植株中能正常转录并导致内源SBE mRNA含量下降.对转基因植株淀粉分支酶活性和淀粉含量测定结果表明,分支酶活性明显地低于对照,相差最多的低85%;总淀粉含量与对照之间基本没有差异,但直链淀粉的含量提高了约50%.     

盐藻蛋白质组的研究进展

盐藻是一种公认的能耐受高盐度的海藻,是研究植物高盐适应的模式生物.高通量的蛋白质组学为人们深入探讨盐藻的耐盐机制提供了强有力的工具.就蛋白质组及其主要技术、盐藻蛋白质组的研究概况和研究展望作一简要综述.     

胰蛋白酶抑制剂基因siRNA表达体系的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了siRNA表达体系。利用农杆菌介导法将带有pBIKSTI3的菌株转化大豆,从2棵再生植株中得到2 100bp的特异性扩增条带,而未转化的植株中无该片段的产生。     

盐藻新基因DsSTPK的克隆及生物信息学分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了杜氏盐藻DsSTPK的1种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（GenBank accession No.JN625213）,命名为DsSTPK,并对其进行了生物信息学分析. 结果表明,盐藻DsSTPK基因的cDNA全长为3 129 bp,可阅读框为2 184 bp,编码727个氨基酸.该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜区域,为非跨膜蛋白,且定位于细胞质基质,二级结构的主要元件为无规卷曲和α 螺旋,三维建模成功,在167~190位有1个蛋白激酶的ATP结合区、293~305位1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区,存在多个潜在的磷酸化位点.进一步的进化分析表明,其与衣藻、团藻亲缘关系最近. 这些研究结果为进一步阐明DsSTPK的功能及作用机制奠定了基础.     

玉米淀粉分支酶基因启动子的克隆与功能分析

以玉米品种“吉糯1号”的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到玉米淀粉分支酶基因的启动子序列,克隆到pMD18-TVector上,经测序,该启动子大小为934bp。与已报道的序列比较仅有14个核苷酸发生改变,同源性为98.5%。用该启动子取代植物表达载体pBI121的35S启动子,与GUS基因编码区连接,构建成融合质粒pSBE-GUS。经农杆菌介导法转化烟草,获得了转基因植株。GUS活性检测结果表明,由该启动子序列引导的GUS基因能在种子中表达,而在其他组织中表达微弱或未表达,证实该启动子具有种子特异性表达的功能。     

盐藻小G蛋白基因(DsRab)的克隆及在高盐胁迫下的表达分析

采用RT-PCR和RACE技术扩增了杜氏盐藻小G蛋白基因cDNA全长序列(GenBank Accession No.JN989548),命名为DsRab,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR方法检测盐胁迫下该基因的表达情况。结果表明,DsRab基因的cDNA全长为1 299 bp,开放阅读框(ORF)为612 bp,编码203个氨基酸,5’非编码区78 bp,3’非编码区609 bp;保守性结构域分析可知编码的小G蛋白有4个GTP/GDP保守结构域,1个效应区、1个羧基端的半胱氨酸结构域和5个Rab亚家族共有的结构域;二级结构预测表明该蛋白有32.02%的α-螺旋,23.65%的伸展片段,44.33%的自由卷曲,三维建模成功;比对分析发现DsRab蛋白与多种生物的Ypt/Rab的氨基酸序列具有较高的同源性。荧光定量PCR结果表明,盐藻在高盐(3.0 mol/L)胁迫下,DsRab基因表达量显著上调,1 h后表达量达到最大值,为正常培养下对照组(0 h)的4.9倍,差异极显著(P<0.01)。     

轮状病毒VP7基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-Tvectr载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为981 bp.将轮状病毒VP7基因定向的克隆到植物表达载体pBI121启动子下游,构建了植物表达载体.