铜绿假单胞菌群体感应信号分子PQS的功能多样性研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性条件致病菌,可对免疫功能低下或损伤的患者造成持续性感染。铜绿假单胞菌能成功感染离不开其自身产生的毒力因子,而这些毒力因子大多数都受群体感应系统(quorum sensing,QS)调控。铜绿假单胞菌有4个QS系统,分别为las系统、rhl系统、pqs系统和iqs系统。2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(Pseudomonas quinolone signal,PQS)作为铜绿假单胞菌pqs系统的信号分子,不仅能够调控许多毒力因子的表达,也能够影响一些微生物和宿主的多种生理过程。本文总结了PQS多种生物学功能,如介导QS系统、调控生物被膜形成、介导外膜囊泡产生及铁摄取、调节宿主免疫活性、介导细胞毒性作用,以及提供种群保护等。本文旨在突出铜绿假单胞菌PQS的功能多样性,并为PQS新功能研究和抗菌药物的研发提供指导。     

恶臭假单胞菌中3-酮脂酰ACP还原酶FabG5是脂肪酸合成关键酶

3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化脂肪酸合成中的第一步还原反应,是细菌生长的关键酶之一.恶臭假单胞菌在环境污染治理和工业聚羟基脂肪酸(PHA)的生产中,都具有重要的应用价值.生物信息学分析显示,恶臭假单胞菌基因组编码6个FabG同源蛋白质,与大肠杆菌FabG相比较,PpFabG5序列相似性最高(76.5%),其他几个PpFabG也都具有较高的序列相似性(约50%).除PpFabG4之外,其他的同源蛋白质都具有催化活性位点和N端辅因子结合位点.为研究恶臭假单胞菌中这6个FabG同源蛋白质的生物学功能,本文进行了异体遗传互补、体外酶学活性分析、体内基因敲除与突变株性状分析等研究.结果显示,只有PpfabG1、PpfabG3、PpfabG5能恢复大肠杆菌fabG温度敏感突变株CL104在42℃时生长,其中PpfabG1互补株生长较弱.而在体外活性检测中,PpFabG1、PpFabG3和PpFabG5在脂肪酸合成起始反应和延伸反应中都具有催化活性,但PpFabG1活性较弱,PpFabG6仅在起始反应中具有催化活性. PpfabG5是恶臭假单胞菌生长的必需基因,不能被敲除,而其他几个PpfabG基因敲除后不影响菌体的生长,突变株的脂肪酸组成与野生菌也无差异.但PpfabG1、PpfabG2敲除后菌体的运动性下降,PpfabG3、PpfabG6突变影响了生物被膜的合成量,而PpfabG4、PpfabG6敲除突变株对H2O2的耐受性增强,表明这些基因具有不同的生理功能,可能在菌体的不同逆境中发挥作用.     

细菌群体感应参与铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控

群体感应是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制。铜绿假单胞菌中QS系统由lasI和rhlI合成的信号分子3OC12-HSL和C4-HSL以及各自的受体蛋白LasR、RhlR组成,它们以级联方式调控多个基因表达。【目的】研究细菌群体感应(QS)对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【方法】利用铜绿假单胞菌PAO1及其QS突变株为材料通过气相色谱、荧光定量PCR在生理和分子水平上研究QS对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【结果】QS信号分子合成抑制剂阿奇霉素处理铜绿假单胞菌PAO1和QS突变株导致胞内PHA积累量显著减少;铜绿假单胞菌PAO1中C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210胞内PHA积累量与野生型无差别;而3OC12-HSL合成酶基因lasI缺失突变株PAO55、3OC12-HSL受体合成酶基因lasR缺失突变株PAO56以及lasI/lasR双缺失突变株PAO57胞内PHA含量与野生型相比明显减少;lasI和lasR的突变株体内PHA合成酶基因phaC1的表达量显著降低,信号分子3OC12-HSL回补实验使phaC1的表达量可恢复到野生株水平,但只可部分恢复lasI缺失导致的胞内PHA合成。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌群体感应系统中lasI/lasR系统参与胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控。     

基于多酶级联协调表达策略高效催化合成 (S)-2-羟基丁酸

2-羟基丁酸 (2-hydroxybutyric acid,2-HBA) 是合成生物可降解材料和各种药物的重要中间体,化学法合成的外消旋2-HBA需要去消旋才能获得光学纯对映异构体,应用于工业。文中通过在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中共表达苏氨酸脱氨酶 (Threonine deaminase,TD)、l-乳酸脱氢酶 (l-lactate dehydrogenase,LDH)和甲酸脱氢酶 (Formate dehydrogenase,FDH),构建 (S)-2-HBA的合成途径及其辅因子NADH的循环系统,实现了基于三酶级联反应催化底物l-苏氨酸合成 (S)-2-HBA。为了解决多酶级联催化反应中中间产物2-酮丁酸的生成速率和消耗率不匹配的问题,文中通过启动子工程策略来调控TD和FDH的表达水平,获得了多酶催化速率平衡的重组大肠杆菌P21285FDH-T7V7827。在5 L发酵罐水平,全细胞催化反应16 h,(S)-2-HBA的最高产量为143 g/L,摩尔转化率为97%,为迄今报道的最高产量的1.83倍,使其具有较强的工业化应用潜力。此外,结果表明,在单细胞中构建可调节的多酶协调表达系统对生物催化制备羟基酸类化合物具有重要意义。     

假单胞菌生物被膜核心胞外多糖生物合成系统研究进展

胞外多糖是假单胞菌生物被膜的重要组成部分,能增强菌体对外界环境、抗菌剂和宿主防御的耐受性.假单胞菌能产生3种与生物被膜形成密切相关的核心胞外多糖:褐藻胶、Psl和Pel,它们在细菌细胞中的合成和转运分别依赖对应的褐藻胶、Psl和Pel生物合成系统.因此,本综述系统全面地总结了假单胞菌3种胞外多糖生物合成系统结构生物学的...     

门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina NK-01合成褐藻寡糖及其结构鉴定

研究发现门多萨假单胞菌NK-01在菌体内积累中长链聚羟基脂肪酸酯(PHAMCL)的同时也能够合成褐藻寡糖分泌到发酵液中,其产量与培养基的碳氮比有关,高碳氮比有利于褐藻寡糖的合成。本研究利用紫外-可见分光光度法、傅立叶红外光谱分析、1H和13C核磁共振对褐藻寡糖的结构进行了分析鉴定,发现褐藻寡糖的结构是由β-D-甘露糖醛酸、α-L-古洛糖醛酸通过β-(1→4)/α-(1→4)键连接而成的无支化线性多糖,并且在单体的2位或3位羟基上部分乙酰化。凝胶渗透色谱(GPC)对分子量的测定结果为2054。     

生物合成对羟基苯甲酸的研究进展

对羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoate,4HBA)是用途广泛的有机原料,现行的生产工艺是以石油成分合成而得,在环境污染不断恶化、人类生存已经面临威胁之际,开发利用可再生资源的生产工艺已成为全球当务之急。本综述在简要介绍从石油成分合成4HBA之后,主要阐述利用植物和微生物从可再生资源合成4HBA的研究进展。莽草酸途径是生物合成芳香族化合物的重要途径,从该途径的最终产物分支酸到4HBA有两条途径。一条是分支酸裂解酶直接催化分支酸生成4HBA(莽草酸-分支酸路线)。另外一条途径是在植物细胞内引入荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的对羟基肉桂酸-Co A裂解酶打通从苯丙素合成4HBA的通路(植物苯丙素路线)。最后介绍了一个天然合成积累4HBA的微泡菌Microbulbifer,并对其深入研究进行了展望。     

应用聚合酶链式反应快速特异鉴定假单胞菌和伯克霍尔德氏菌(R)-3-羟基酯酰载酯蛋白-辅酶A转酰基酶基因

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类具有广泛应用前景的可降解生物塑料。因其可以以葡萄糖等廉价底物直接发酵生产PHA而日益受到重视。目前的研究表明在积累中长链PHA的假单胞菌中,由phaG基因编码的(R)-3-羟基酯酰载酯蛋白-辅酶A转酰基酶(PhaG)起关键作用,但目前为止对该蛋白还知之甚少。通过聚合酶链式反应(PCR)建立了一种快速、特异鉴定phaG基因的方法,应用该方法成功地从两株积累不同PHA的假单胞菌Pseudomonas stutzeri 1317和Pseudamanas nitroreducens 0802中分别克隆得到phaG基因,并在phaG基因突变株Pseudomonas putida PHAGx-21中表达成功。同时,还首次报道了从非假单胞菌菌株Burkholderia caryophylli AS 1．2741中鉴定得到phaG基因,提示PhaG介导的中长链PHA合成途径作为一种通用的代谢模式在细菌中广泛存在,为进一步实现从廉价的非相关底物合成中长链PHA提供了必要的分子生物学基础。     

恶臭假单胞菌NA-1菌株烟酸羟基化酶活性的诱导和转化条件的研究

恶臭假单胞菌NA-1菌株的培养和产酶特性与已报道的产酶菌株粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)IFO12648和荧光假单胞菌(Psudomonasfluorescens)TN5有所不同,主要反映在最适碳源及浓度、最适诱导剂浓度和最适培养温度等方面。最适的转化条件是温度为30℃,pH为7.0,烟酸的浓度为3%。采用初步优化后的条件和流加底物的方式进行4L上罐生产,恶臭假单胞菌NA-1菌株的6-羟基烟酸产率可达到108.39gL。     

假单胞菌合成聚合物和复杂化合物的种类及机理研究进展

假单胞菌合成的代谢产物种类繁多。本文对假单胞菌合成的具有产业化前景或已实现产业化的藻酸盐、维生素B12、环状脂肽、吩嗪、单乙酰基间苯三酚、2,4-二乙酰基间苯三酚、鼠李糖脂以及聚羟基脂肪酸酯等六类复杂化合物或聚合物以及它们合成机制的研究进展进行综述,并就上述物质合成研究的发展方向进行展望。     

荧光假单胞菌抗生性代谢产物合成相关基因的研究现状

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一种重要的植物根际促生菌,它能够产生藤黄绿脓菌素、2,4-二乙酰基藤黄酚、硝吡咯菌素、吩嗪-1-羧酸等抗生性次级代谢产物,可抑制多种病原物,在农作物土传病害的生物防治研究中具有重要意义.总结了荧光假单胞菌中已确立的抗生性次级代谢产物的合成机制,重点阐述了相关基因的结构、功能,以及利用生物工程技术对荧光假单胞菌进行遗传操作的最新进展,同时对荧光假单胞菌在生物防治中的应用和其作为生防菌剂的前景进行了展望.     

荧光假单胞菌M18 rpoD克隆及其对抗生素合成的影响

荧光假单胞菌M18对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomones fluo-rescens)M18能同时合成吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(P1t)两种抗生素。从M18的基因组中克隆了rpoD基因,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中RpoD蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌-荧光假单胞菌穿梭质粒,pME6032,将rpoD置于强启动子Ptac的控制下,导入M18菌株。发现经重组质粒转化的M18,与对照相比,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前4h和8h,积累量提高1倍和6倍.     

直立百部的非生物碱化学成分研究(英文)

从直立百部(Stemona sessilifolia)根中首次分离到十四个非生物碱成分.依据波谱数据,它们鉴定为豆甾醇(1)、4-甲氧基苯甲酸(2)、苯甲酸(3)、3,4-二甲氧基苯酚 (4)、4-甲氧基苯甲酸(5)、4-羟基苯甲酸(6)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(7)、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸(8)、3,3′-bis(3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy)-2H-1-benzopyran(9)、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(10)、羽扇豆烷-3-酮 (11)、绿原酸(12)、胡萝卜苷(13),3-feruoyl-chinasueure (14).化合物5～14为首次从百部属植物中分离得到.     

PH826噬菌体与抗生素联用有效抑制多重耐药铜绿假单胞菌生物被膜的形成

【目的】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种重要的革兰氏阴性病原体,可以加重囊性纤维化患者的肺部感染,最终会导致患者的死亡。然而由于多重耐药(multi-drug resistant,MDR)和泛耐药(pan-drug resistant, PDR)铜绿假单胞菌菌株的出现,使其防控变得更为严峻。【方法】从养殖场污水中分离能有效裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体,研究其形态特征、生物学特性、宿主谱范围、基因组特征和体外抑菌能力等,并采用噬菌体和抗生素联用的方法进行生物被膜的抑制试验。【结果】透射电子显微镜的形态分析和基因组分析结合表明,该噬菌体属于Nankokuvirus病毒属。生物学特性试验表明,PH826具有广泛的温度稳定性(4-60℃)和pH稳定性(3.0-11.0)。宿主谱测试显示,PH826可以裂解13株铜绿假单胞菌(包括人源和动物源),体外抑菌试验显示,PH826在感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别为10、1、0.1时对铜绿假单胞菌均有强烈的裂解作用。根据基因组分析,PH826噬菌体的基因组大小为87 95...     

具ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌的分离、鉴定及其生物学特性

【目的】具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性的盐生植物碱蓬内生细菌的分离及生物学特性的研究有助于探索内生细菌与宿主植物耐盐性的关系。【方法】采用研磨法从健康碱蓬植株的根、茎、叶中分离具有ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌,根据形态特征、生理生化、API鉴定系统和16S rRNA对菌种进行鉴定,并分别测定了菌株产ACC脱氨酶、铁载体、吲哚乙酸、赤霉素、脱落酸、蛋白酶及溶磷、固氮和拮抗病原菌的特性。【结果】将分离得到的内生细菌LP11、SS12、TW1和TW2分别鉴定为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),4株菌除具有较高的ACC脱氨酶活力之外,还可不同程度地产生铁载体、吲哚乙酸、赤霉素和脱落酸,且均有溶磷作用,但无固氮能力及蛋白酶活力,唯有菌株SS12对萝卜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.conglutinans)和黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cucumerinum)具有拮抗作用。【结论】从盐生植物碱蓬中分离到的假单胞菌属和泛菌属内生细菌,具有丰富多样的生物学特性。     

原儿茶酸的生物转化

【背景】原儿茶酸(Protocatechuic acid,PCA)是一些植物的主要活性成分,可作为许多聚合物和药物的前体物质,目前PCA的主要来源是利用化学法从植物中提取,然而该法提取率低且对环境造成一定程度的破坏。【目的】克隆对羟基苯甲酸-3-羟化酶基因ρ-HBA-3H并进行异源表达,利用该酶催化实现原儿茶酸的生物转化。【方法】以红球菌R04基因组DNA为模板,PCR扩增得到对羟基苯甲酸-3-羟化酶基因ρ-HBA-3H,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/pET21a(+)-ρ-HBA-3H,诱导表达对羟基苯甲酸-3-羟化酶,在底物对羟基苯甲酸(ρ-Hydroxybenzoicacid,ρ-HBA)存在下进行PCA的生物转化,并对生物转化的条件进行优化。【结果】对羟基苯甲酸-3-羟化酶基因在大肠杆菌中实现了高效表达。通过生物转化PCA产量可达1.156 g/L。优化实验表明Mg2+、Triton X-100对转化效率无影响,增加反应体系的溶氧量及添加适量的吐温-80能够促进转化反应的进行。细胞连续转化基础上适量补充葡萄糖可以有效增加工程菌的转化效率,减少PCA的消耗。【结论】通过生物酶催化法实现了PCA的高效率、绿色生产,为其他重要发酵产品的工业化生产提供理论研究基础。     

抗菌肽Lfcin15-Me8分子设计及对老年呼吸道致病菌铜绿假单胞菌的抑菌性能分析

探讨人工设计合成的Lfcin15-Me8分子对老年病患者中铜绿假单胞菌抑菌活性研究。从老年病患痰液中分离鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染情况,截取牛乳铁蛋白素(Lfcin B)1-15和蜂毒素(Melittin)1-8核心氨基酸序列,固相合成新型抗菌肽分子,采用微量肉汤稀释法,测定新型抗菌肽分子对临床分离菌株的抑菌活性。结果显示,铜绿假单胞菌占院内感染的32.2%,位列致病菌第二位。合成的新型抗菌肽分子Lfcin15-Me8,为阳离子型抗菌肽,并富含α-螺旋。对临床铜绿假单胞菌抑菌MIC值均达到128μg/m L以下,其中最低达到32μg/m L,具有良好抗菌活性。铜绿假单胞菌在老年呼吸道感染中占较大比重,需注意防控,人工合成的Lfcin15-Me8分子可抑制临床铜绿假单胞菌的生长繁殖。     

粗糙肉齿菌子实体化学成分研究

利用硅胶柱层析、RP-8层析及Sephadex LH-20分离的方法,从高等真菌粗糙肉齿菌(Sarcodon scabrosus)干燥子实体的甲醇提取物中分离并鉴定了8个化合物,经现代光谱技术鉴定分别为苯甲酸(1)、麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(2)、2',3'-二乙酰基-3,4,5',6',4″-五羟基-对联三苯(3)和1-乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、对羟基苯甲酸(5)、丁二酸(6)、腺嘌呤(7)、腺嘌呤核苷(8).以上化合物均为首次从粗糙肉齿菌中获得.     

rpoS基因插入突变对铜绿假单胞菌两个吩嗪合成基因簇的调控

【目的】为了研究铜绿假单胞菌rpoS基因对吩嗪(Phenazine)合成基因簇phz1和phz2的调控方式与机制。【方法】采用抗庆大霉素基因(gentamycin resistance cassette,aacC1)插入失活的策略构建了rpoS基因突变株PA-SG;同时利用lacZ的翻译融合表达载体pME6015,构建了phz1′-′lacZ和phz2′-′lacZ翻译融合表达载体pMEZ1和pMEZ2。采用电转化法分别将pMEZ1、pMEZ2和pME6015导入铜绿假单胞菌突变株PA-SG和野生株PAO1,用Miller法检测融合β-半乳糖苷酶活性。【结果】在KMB或PPM培养基中,pMEZ1在突变株PA-SG中的表达均增强,为野生株的4-5倍;而pMEZ2在突变株PA-SG中的表达均降低,野生株是突变株的2-3倍。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌rpoS基因对两个不同吩嗪合成基因簇的调控作用具有特异性,在一定程度上,rpoS负调控phz1,正调控phz2。     

生防绿针假单胞菌HT66中脂肽的鉴定与功能

【目的】脂肽(Lipopeptide,LP)是微生物合成的一类重要的生物表面活性剂,不仅影响细菌的生物学功能,还对多种植物和人类病原菌具有广谱的拮抗作用。然而至今未见绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)中脂肽产物的报道。【方法】通过生物信息学手段预测绿针假单胞菌HT66中脂肽的氨基酸组成及顺序,构建脂肽合成基因缺失突变株HT66Δclp,根据突变株缺失代谢产物的UPLC/QTOF-MS信息验证预测结果,并研究了脂肽对该菌株的生长、吩嗪-1-甲酰胺(PCN)合成、生物膜形成和群集运动性的影响。【结果】预测菌株HT66的脂肽氨基酸顺序为L-Leu–D-Glu–D-allo-Thr–D-Val–L-Leu–D-Ser–L-Leu–D-Ser–L-Ile,通过比对野生型和突变株代谢产物的质谱信息确定该产物为黏液菌素(Viscosin);脂肽合成基因缺失后,菌株HT66的生长无明显变化,但其PCN合成、生物膜形成和群集运动性均有不同程度地下降。【结论】菌株HT66的脂肽产物为黏液菌素,对菌株的代谢、生物膜形成和运动性等生物学功能具有重要的调控作用。研究报道了绿针假单胞菌中一种脂肽分子的结构与功能,为研究其合成和调控机制及开发和应用奠定了基础。