转座子标签法突变呋喃丹降解菌CFDS-1

通过接合使供体大肠杆菌DH5α中的质粒pSC123上的转座子插入到受体菌CFDS-1基因组DNA中,以引起该菌株的基因插入突变。利用转座子上的卡那霉素抗性基因和呋喃丹降解过程中红色物质的产生与否初步筛选出6株突变株,分别命名为CFDS—M1～CFDS—M6。紫外扫描和气谱检测结果进一步证明这些突变子确实失去了对呋喃丹的降解能力。根据转座子的序列设计引物,以6株突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对PCR产物进行限制性酶切分析,结果表明这些突变子中呋喃丹降解基因的失活就是由于转座子的插入而导致的。     

转座子标签法突变呋喃丹降解菌CFDS-1*

通过接合使供体大肠杆菌DH5α中的质粒pSC123上的转座子插入到受体菌CFDS1基因组DNA中,以引起该菌株的基因插入突变。利用转座子上的卡那霉素抗性基因和呋喃丹降解过程中红色物质的产生与否初步筛选出6株突变株,分别命名为CFDSM1～CFDSM6。紫外扫描和气谱检测结果进一步证明这些突变子确实失去了对呋喃丹的降解能力。根据转座子的序列设计引物,以6株突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对PCR产物进行限制性酶切分析,结果表明这些突变子中呋喃丹降解基因的失活就是由于转座子的插入而导致的。     

水稻转座子研究进展

转座子是植物基因组的重要组成部分,对于研究植物基因组进化等具有重要意义。随着水稻全基因组测序计划的开展和完成,水稻转座子研究取得了极大进展,目前已经在水稻基因组中发现了几乎所有类型的转座子,约占水稻基因组的35%。在正常情况下,大多数水稻转座子不具有转座活性,但是在特定的条件下（如组织培养或辐射等）,水稻基因组中沉默的转座子可以被激活,从而可能导致插入突变并影响基因的表达。在水稻中已鉴定出6个有活性的转座子,其中Tos17已被应用到水稻功能基因组研究中。转座子序列的新的分子标记转座子展示（transposon display,TD）现已被开发,并在水稻遗传作图和遗传分化研究中得到应用。     

转座子Tn917及其应用

利用转座子和整合载体发展了一系列技术,这些技术包括：（l）插入中断染色体基因,确定基因是否有功能;（2）在所感兴趣的基因近侧翼插入筛选标记和报告基因（reIX）rtergene）,使研究基因结构及转录调节方式等变得容易;（3）经改造的基因再导人染色体和通过重组把外源基因导人质粒、噬菌体及宿主菌的基因组,进行菌种改良。近年来,转座子Tngl7及其衍生载体被用于枯草杆菌（ffesilluSSSbrtlis,BS）或其它革兰氏阳性（G”）菌的染色体突变、基因转移等,并已成为改良菌种的一种新途径。ITngl7的发现和性质1979年TotheCh等l’啃先…     

PNP降解相关基因温敏突变株的分离及其特性研究

通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变株中得到1株温度敏感型突变株MT54。根据转座子上的已知序列设计引物以MT54基因组DNA为模板进行PCR扩增,证实MT54的染色体中有转座子插入。MT54在30℃条件下能够以对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)为唯一碳源生长,但在37℃不能生长。格里斯试色剂法检测NO_2~-的生成情况进一步证明了MT54的这种特性。通过30℃和37℃两种温度条件下MT54和原始出发菌株DLL-E4对PNP和对苯二酚降解情况的比较,推测温敏突变位点可能发生在与PNP降解相关的基因中。     

构建胸膜肺炎放线杆菌apxIC基因插入突变株

目的：构建胸膜肺炎放线杆菌（APP）apxIC基因插入突变菌株,以鉴定ApxⅠ毒素的生物学特性。方法：根据apxⅠ核酸序列（U05042）设计1对引物,用于自APP血清10型参考菌株（D13039）基因组DNA中扩增apxIC基因及其上下游约2．8kb的基因片段,经克隆测序后在apxIC基因下游xbI酶切位点处插入约0．9kb的氯霉素（Chl）抗性基因表达盒,构建用于转化的转移载体pUIC-Chl^r,将转移载体DNA经电转化导入APP血清10型参考菌株中进行同源重组,以获得突变菌株。结果：在含有氯霉素的培养基中经筛选获得2株丧失溶血活性的突变菌株（D13039C-Chl^r）;利用PCR和Southern blot对突变菌株鉴定,显示氯霉素抗性基因已被插入细菌基因组中。结论：利用电转化和同源重组技术构建成功APP apxIC基因插入突变菌株,为分析ApxⅠ毒素的生物学特性,进而研制APP基因工程减毒活疫苗奠定了基础。     

转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点的定位分析

为寻找谷氨酸棒杆菌转座子插入突变菌株中的转座子插入位点,采用了转座子挽救法对转座子及其插入位点附近的序列进行分离,并测定插入位点相邻DNA序列,获得了三个转座子插入位点DNA序列,其中一个是柠檬酸合成酶基因,另两个为目前未知基因,暂命名为orfA和orfB。该方法简便易行,是分析转座子插入位点的理想方法。     

插入突变在功能基因组学研究中的应用

插入突变库的构建是功能基因组学研究的一个重要内容,可为确定基因的功能提供最直接的证据。构建插入突变库的方法有T-DNA插入突变、转座子插入突变和质粒介导的插入突变。本文分别介绍三种方法的原理及其在功能基因组学研究中的应用和研究进展。     

利用Tn5-1063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BM noeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn5-1063(含luxAB)的质粒pRL1063a导入苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meldoti)042BM,进行转座子插入诱变,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验,从1000个突变株中,筛选到3个结瘤突变株042BMR5、042BMR11和042BRM29。它们都表现出发光酶活性,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实,转座子均为单一位点插入。对042BMR5突变株基因组进行反向PCR,扩增位于Tn5-1063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymA noeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出042BM noeB,其与苜蓿中华根瘤菌1021 noeB的同源性为98％,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为95％。疏水性分析发现,NoeB是一个跨膜蛋白,在N末端有4个跨膜区,其中包含3个初级螺旋和1个次级螺旋。     

斑马鱼sat1.a突变体的鉴定

目的在我们的前期研究工作中,通过Tol2转座子介导的插入突变,筛选到了一批组织特异性表达绿色荧光蛋白GFP的斑马鱼品系。其中一个品系Tol2:20141221t的GFP在神经系统中表达,但还没有鉴定到Tol2转座子插入到基因组什么位置,造成了哪个基因的突变。本文的主要研究目标就是对这一由Tol2转座子插入诱导的斑马鱼突变品系进行鉴定。方法使用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)鉴定Tol2转座子插入的基因组位置;利用原位杂交检测被突变的基因的时空表达是否与该品系GFP表达具有一致性;筛选鉴定纯合体突变体,并进一步分析该基因突变造成的发育缺陷。结果在该品系中,Tol2转座子插入到了亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶1a(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1a,sat1.a)的第八个内含子区域,致使sat1.a基因转录提前终止。我们筛选到了sat1.a纯合突变体,但是没有检测到明显的发育缺陷。结论筛选鉴定的Tol2转座子介导的斑马鱼sat1.a突变体没有明显的发育缺陷,但可以作为研究神经系统发育的有力工具。     

水稻转座子研究进展

转座子是植物基因组的重要组成部分, 对于研究植物基因组进化等具有重要意义。随着水稻全基因组测序计划的开展和完成, 水稻转座子研究取得了极大进展, 目前已经在水稻基因组中发现了几乎所有类型的转座子, 约占水稻基因组的35%。在正常情况下, 大多数水稻转座子不具有转座活性, 但是在特定的条件下(如组织培养或辐射等), 水稻基因组中沉默的转座子可以被激活, 从而可能导致插入突变并影响基因的表达。在水稻中已鉴定出6个有活性的转座子, 其中Tos17已被应用到水稻功能基因组研究中。转座子序列的新的分子标记转座子展示(transposon display, TD)现已被开发, 并在水稻遗传作图和遗传分化研究中得到应用     

基因捕获技术及其最新进展

基因捕获技术是目前最具应用前景的基因克隆方法之一。利用该技术建立的随机插入突变的突变体文库,可用于寻找、鉴定和研究大量末知功能和已知功能的活化基因,它是继自然突变、物理突变和化学突变之后发展起来的新的分子生物学方法。基因捕获载体是带有报告基因和/或选择标记基因的不完整的基因表达载体;这些载体所带的基因只有在整合到宿主功能基因内部且与融合的宿主基因编码框一致时才能得以表达。经典的基因捕获载体有：增强子捕获载体、基因捕获载体和启动子捕获载体。增强子载体只有一个最小化的启动子控制下游报告基因的表达活性。只有当启动子上游存在一个增强子时才能启动其下游基因的转录：而单独依靠这个启动了则不能转录。狭义的基因捕获载体是指插入到结构基因内部从而捕获该基因的载体,分为内含子捕获载体和外显了捕获载体。前者插入内含子,因此需要在无启动子的报告基因前面添加一个splice acceptor（SA）位点：后者插入外显子,因此不需SA位点就能产生融合蛋白mRNA。启动子捕获载体由一个无启动子的报告基因和选择标记基因组成,只有在捕状载体捕入到内源基因的外显子中,且两阅读框一致的时候才会有报告基因和被捕获的内源基因上游编码区的融合蛋白的表达。利用某些遗传元件的遗传特性也可以构建非常有用的捕获载体。常用的有：逆转录病毒介导的捕抉载体和转座子介导的捕荻载体等等。该文较为全面地概括了转座子介导的捕获载体的用途和研究现状。比如：在拟南芥中应用Ac／Ds转座子元件,存果蝇中应用P-element和piggyBac转座元件,在斑马鱼中应用T012转座了元件,在脊椎动物研究中应用Tc1/meriner转座了超家族,以及存哺乳动物和小鼠ES细胞中应用piggyBac转座子元件。还列举了设计新颖的载体优化策略,比如：发展新的选择标记基因,利用内源核糖体识别／结合位点（IRES）,去掉起始密码子和加一小段接头（1inker）等方法。最后介绍了几种针特定实验目的而设计的捕获载体。附录部分还列出了关于基因捕获技术的网络资源。     

Mutator转座子及MULE在植物基因与基因组进化中的作用

Mutator（Mu）转座子是植物中已发现的转座最活跃的转座子,其高的转座频率及趋向于单拷贝功能基因转座的特性,使该转座子成为玉米功能基因克隆的主要方法.Mu转座子的同源类似因子广泛存在于被子植物基因组中,而且同一基因组中往往具有多种变异类型.它不仅具有其他DNA转座子在基因和基因组进化中的普遍作用,而且具有能够承载基因组内功能基因和基因片段的载体功能,这种载体Mu转座子（Pack-MuLEs）能够在基因组内移动众多的基因片段,从而对基因和基因组进化产生作用.Mu转座子的同源序列发生在水稻与狗尾草之间的水平转移提供了高等植物核基因水平转移的首个例证.对Mu转座子的了解促进了我们对动态基因组概念的认识.文章对Mutator转座子的发现、转座特征、基因标签应用等的研究进展进行了综述,对Mu转座子家族的同源序列进行了分类,讨论了该转座子在基因组进化中的作用,分析了应加强研究的问题.     

TAIL-PCR方法快速分离Xcc致病相关基因序列

以mini-Tn5 gfp-km转座子中nptⅡ片段作为探针,对已获得的五株野油菜黄单胞菌野油菜黑腐病致病型（Xcc)非致病突变体进行了Southern blot分析,结果表明,这五株突变体确由mini-Tn5 gfp-km转座子插入致病相关基因所致,且为单拷贝不同位点的插入。提取这五株突变体总DNA作为模板,采用改进的热不对称交错PCR（TAIL－PCR）方法从其中克隆到了各自转座子插入区侧翼序列,对这些侧翼序列进行了序列测定并将分析结果与GenBank database及Xcc全基因组序列做了比较,结果表明,五个侧翼序列所在的基因确与Xcc致病性有关。这种改进后的TAIL－PCR方法为突变体特别是转座子插入突变体中目的基因的克隆提供了一种简要高效的新方法。     

限制酶介导的插入突变及其在丝状真菌中的应用

克隆基因的方法很多,通过突变是克隆基因的常用方法,如转座子标签法常用于克隆植物病原细菌致病相关基因及植物的抗病基因。尽管转座因子在丝状真菌中也普遍存在,但对它们的转座作用和功能了解不多,迄今转座子标签法还没有发展成为标记真菌突变体和基因克隆的常规技术。而一般的ＵＶ或化学突变方法又将使突变基因的鉴定和克隆遇到许多问题。用质粒ＤＮＡ转化真菌时,也会发生非同源随机插入真菌基因组而形成标记的突变体,但往往由于转化频率较低等因素而难以广泛应用。新近的研究发现,在限制酶介导下大多数真菌的质粒ＤＮＡ转化频率明…     

鱼腥藻PCC7120基因组中一个影响异形胞发育和图式形成的新区域

以Tn5 10 87b诱变鱼腥藻PCC712 0 ,筛选不能利用氮气生长、异形胞图式发生变化的突变株。突变株 # 180 1经缺氮诱导 2 4h后无异形胞形成 ,48h后沿藻丝形成少量成熟异形胞 ,占藻细胞总数比例为 2 .8% ,其异形胞发育速度和形成频率均与野生型有显著区别。以ClaⅠ酶切该突变株总DNA、自环化后以电泳冲法转化大肠杆菌 ,回收带有插入位点两侧DNA片段的转座子Tn5 10 87b。经测序确定转座子位于未知功能基因alr0 0 99第 14 8和 14 9碱基之间。为证明突变性状确由alr0 0 99内的插入突变引起而不是由于其他二次突变 ,通过同源双交换将含新霉素抗性基因的C .K2片段定向插入基因组中alr0 0 99的EcoRV位点 ,获得重构的鱼腥藻突变株DR2 14 ,其表型与原突变株 # 180 1相同。以上结果表明alr0 0 99或其下游基因是鱼腥藻PCC712 0基因组中与异形胞发育和图式形成相关的一个新区域。     

鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6．5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT—PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F／HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmBI将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基插入突变成功,F／HN基因区域碱基突变均得以纠正。以上cDNA克隆的修饰与替换为该毒株的反向遗传研究打下了基础。     

piggyBac转座子在牛基因组的整合位点及特征分析

piggyBac(PB)转座子作为一种遗传工具被广泛应用于多个物种的转基因及插入突变研究, 目前PB转座子在牛中的相关研究还较少。为了获得PB转座子在牛基因组中的整合位点, 总结其转座特征, 文章构建了PB[CMV-EGFP]和pcDNA-PBase二元转座系统, 利用细胞核电转技术共转染牛耳组织成纤维细胞, 经G-418筛选, 获得了稳定转染EGFP的转基因细胞系; 提取细胞基因组DNA, 利用基因组步移技术扩增PB转座子5′ Bac区插入位置的DNA序列; 通过与牛基因组序列进行BLAST比对, 得到PB转座子在牛基因组中的插入位点。文章共获得了8个有效的整合位点, 但仅有5个位点定位到染色体1、2、11和X染色体上。序列分析表明：在牛基因组中, PB转座子可特异性的插入到“TTAA”位置, 并整合到基因间的非调控区; 分析整合位点“TTAA”相邻一侧的5个碱基组成, 发现PB转座子5′端倾向于插入到GC(62.5%)碱基富集区。该研究表明, PB转座子可以在牛基因组中发生转座, 获得的整合位点信息为利用PB转座子在牛上开展遗传学研究提供了理论参考。     

利用Tn51063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BMnoeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn51063（含luxAB）的质粒pRL1063a导入苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM,进行转座子插入诱变,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验,从1000个突变株中,筛选到3个结瘤突变株042BMR5、042BMR11和 042BRM29。它们都表现出发光酶活性,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实,转座子均为单一位点插入。对042BMR5突变株基因组进行反向PCR,扩增位于Tn51063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymA noeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出042BM noeB,其与苜蓿中华根瘤菌1021 noeB的同源性为98％,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为95％。疏水性分析发现,NoeB是一个跨膜蛋白,在N末端有4个跨膜区,其中包含3个初级螺旋和1个次级螺旋。     

转座子相关技术在微生物功能基因组研究中的应用

转座子是DNA插入因子的一种,是指能在基因组间或组内跳跃的DNA片段。转座子作为插入突变剂或分子标签已被广泛地应用于基因的分离和克隆,且因其独特的性质已成为发现新基因和基因功能分析的有效工具。这使得转座子无论是在单基因水平还是全基因组水平,都成为细菌、酵母和其他微生物研究的有力工具。简单而有效的体外转座反应可以对一些以往难以进行分析的顽固微生物进行转座诱变分析。而建立在转座子基础上的信号标签诱变技术和遗传足迹法的应用则发现了一些新的病原微生物毒力因子,从而可以更好地对这些病原微生物的致病机理进行阐述。这些再次说明转座子是微生物功能基因组研究中的有力工具。本文综述了转座子及其衍生载体介导的一些技术,并讨论其在微生物功能基因组研究中的应用。