利用转基因小鼠筛选全人源炭疽致死因子中和抗体

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的严重威胁人类健康的传染病。炭疽毒素包括3种蛋白质成分:保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。PA与LF形成致死毒素(LT),与EF形成水肿毒素(ET)。由于致死毒素(LT)在感染者损伤及死亡中发挥主要作用,因此在炭疽感染晚期单纯使用抗生素治疗难以发挥疗效,治疗性中和抗体成为目前最有效的炭疽治疗药物。目前国外获得的炭疽毒素抗体多为炭疽PA抗体,美国FDA已批准瑞西巴库(人源PA单抗)用于吸入性炭疽的治疗。一旦炭疽芽孢杆菌被人为改构或PA中和表位发生突变,针对PA单一表位的抗体将可能失效,因此针对LF的抗体将成为炭疽治疗的有效补充。目前国外已有的LF抗体多为鼠源抗体和嵌合抗体,而全人源抗体可以避免鼠源抗体免疫原性高等缺点。本研究首先用LF抗原免疫人抗体转基因小鼠,利用流式细胞仪从小鼠脾淋巴细胞中分选抗原特异的记忆B细胞,通过单细胞PCR方法快速获得两株具有结合活性的抗LF单抗1D7和2B9。瞬时转染Expi 293F细胞制备抗体,通过毒素中和实验(TNA)发现1D7和2B9在细胞模型中均显示较好的中和活性,并且与PA单抗联合使用时,表现出较好的协同作用。总之,本文利用转基因小鼠、流式分选技术和单细胞PCR技术的优势,快速筛选到全人源LF抗体,为快速筛选全人源单克隆抗体开辟了新的思路与方法。     

炭疽毒素及其细胞受体的研究进展

炭疽毒素由 3种蛋白组成 :保护性抗原 (protectiveantigen ,PA)、致死因子 (lethalfactor,LF)和水肿因子 (edemafactor ,EF) .综述炭疽毒素研究的最新进展 .主要介绍炭疽毒素的关键致病因子———LF的结构与功能 ,炭疽毒素膜转运成分PA的结构及其受体 (anthraxtoxinreceptor ,ATR)和其cDNA克隆的结构 ,并讨论了在炭疽的治疗、预防和毒素在肿瘤治疗中的可能应用 .     

人类蛋白质结构互作网络——结构域对网络拓扑与蛋白质功能的影响

高通量的蛋白质互作数据与结构域互作数据的出现,使得在蛋白质组学领域内研究人类蛋白质结构互作网络,进一步揭示蛋白质结构与功能间的潜在关系成为可能.蛋白质上广泛分布的结构域被认为是蛋白质结构、功能以及进化的基本功能单元.然而,结合蛋白质的结构信息(例如蛋白质结构域数目、长度和覆盖率等)来研究这些表象后的内部机制仍然面临着挑战.将蛋白质分为单结构域蛋白质与多结构域蛋白质,并进一步结合蛋白质互作信息与结构域互作信息构建了人类蛋白质结构互作网络;通过与人类蛋白质互作网络进行比较,研究了人类蛋白质结构互作网络的特殊结构特征;对于单结构域蛋白质与多结构域蛋白质,分别进行了功能富集分析、功能离散度分析以及功能一致性分析等.结果发现,将结构域互作信息综合考虑进来后,人类蛋白质结构互作网络可以提供更多的单纯的蛋白质互作网络无法提供的细节信息,揭示蛋白质互作网络的复杂性.     

针对炭疽保护性抗原不同结构域的中和性单克隆抗体的筛选和鉴定

炭疽保护性抗原（PA）是炭疽毒素的重要组分,同时也是现有炭疽疫苗的主要有效成分,在炭疽杆菌的致病与免疫中发挥关键作用。以重组PA为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,结合炭疽毒素敏感细胞的毒性中和试验,大量筛选抗PA单克隆抗体,获得了9株炭疽毒素中和性单抗。进一步分析表明这些单抗以IgG1亚类为主,分别识别PA 3个结构域的4个不同中和表位区。针对结构域2的4株单抗识别同一表位区,其中3株单抗的中和活性强于抗PA多抗;针对结构域4的4株单抗识别两个不同表位区;另有1株单抗识别位于结构域3的表位。实验结果提示PA具有多个中和表位,分别位于其不同结构域,其中结构域2、4包含主要中和表位。实验中获得的针对不同表位的中和性单抗为深入研究PA的免疫保护机理提供了工具,也为研制针对炭疽毒素的被动免疫制剂和治疗药物打下基础。     

人用炭疽菌苗的研究进展

<正>炭疽是一种人兽共患的急性传染病,羊、牛、马等家畜易患本病,人由于接触炭疽病畜或屠宰、剥食而受染。炭疽的病原体是炭疽杆菌,是一种需氧芽胞杆菌。炭疽菌的毒力除决定于染色体基因外,还与两个编码质粒致病因子有关:一个是荚膜质粒(编码pxo2),主要是聚—D—谷氨酸,在体内能抑制细胞的吞噬作用,在体外能阻断菌体胞壁上的噬菌体受体,故常称为侵袭因子,有助于病菌在体内繁殖扩散和建立感染;另一个是炭疽毒素质粒(编码pxo1),由致死因子(LF)、水肿因子(EF)和保护性抗原(PA)三种成分组成。三种成分单独注射动物未证明有毒素活性,但若将LF加PA静脉注射可致死小白鼠、大白鼠和豚鼠。EF加PA皮内注射可引起豚鼠和家兔皮肤水肿。三种毒素成分的分子量在80～90KDa之间,可能PA结合     

BAR结构域蛋白质的功能

近期对果蝇双载蛋白(amphiphysin)BAR结构域晶体结构的报道,使得BAR结构域研究成为热点。虽然在序列水平上保守性较低,但双载蛋白的BAR结构域与Arfaptin 2的GTP酶结合结构域在结构上极为相似。通过对两种蛋白质的BAR结构域同源序列进行检索分析,发现了大量含BAR结构域相关蛋白质。研究发现,BAR结构域蛋白质多数都参与细胞内物质转运及胞吞作用;BAR结构域不仅可以通过其二聚化基元感知和诱导膜的弯曲,而且某些蛋白质的BAR结构域还具有与小GTP酶结合的功能。     

MBD4/MED1的结构与功能

含甲基化CpG结合域蛋白质4(methyl-CpG-binding domain protein 4,MBD4)是MBD核蛋白家族中的一员,它包含一个能特异结合甲基化CpG的MBD结构域和一个具有糖苷酶活性的DNA糖苷酶结构域。该蛋白质能特异地结合甲基化CpG岛,并且在DNA错配修复、抑制转录和调节凋亡等过程中发挥重要功能,并与微卫星不稳定性密切相关。MBD4是一个重要的DNA损伤修复蛋白,多方面的报道表明其许多功能都牵涉到细胞衰老。本文就其结构与功能的研究进展作一综述。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用

苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性片段包含三个不同的结构域。通过对毒性片段编码基因的定点诱变和体外重组 ,已经对结构域的功能有了较清晰的认识。一般认为结构域Ⅰ参与孔道的形成 ,结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合 ,结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。本文根据国外研究 ,从毒素蛋白质结构的不同组织层次 ,阐述了这些区域的结构与其功能的关系。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用

苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性片段包含三个不同的结构域。通过对毒性片段编码基因的定点诱变和体外重组 ,已经对结构域的功能有了较清晰的认识。一般认为结构域Ⅰ参与孔道的形成 ,结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合 ,结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。本文根据国外研究 ,从毒素蛋白质结构的不同组织层次 ,阐述了这些区域的结构与其功能的关系。     

基于去折叠自由能的蛋白质结构域划分方法——适用于连续与不连续结构域

结构域是蛋白质的一个结构层次 ,可以看作是蛋白质结构、折叠、功能、进化和设计的基本单位。大多数的蛋白质都可分为若干个结构域 ,结构域的不同组合使蛋白质具有不同的三级结构并具有不同的功能。蛋白质结构域的划分在理论与应用上都具有重要意义 ,但目前对结构域的划分还没有一个十分理想的方法。作者曾经发展了一种通过计算去折叠自由能划分蛋白质结构域的方法 ,但该方法只适用于连续双结构域的划分。现在 ,作者通过构造氨基酸残基相互作用矩阵 ,并进行对应分析 (correspondenceanalysis) ,然后根据去折叠自由能和一些经验打分函数对蛋白质进行切割和优选 ,发展了可以同时处理连续和不连续结构域的划分方法。该方法与晶体结构作者手工分析相比较 ,二者的结果有 76 %的相似。     

炭疽毒素保护性抗原第四结构域在大肠杆菌中的可溶性表达

人工优化设计并合成炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并与噬菌体gⅢ蛋白N端结构域基因融合,在大肠杆菌中可溶性表达融合蛋白。结果表明合成了炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并在大肠杆菌中获得了高效可溶性融合表达,可溶性表达产物占细菌总蛋白量的36％左右;经亲和层析纯化获得了重组蛋白;Western印迹分析表明,表达产物能与His单抗（重组蛋白羧基端带有6xHis）发生特异性结合反应。以上结果表明获得了炭疽毒素保护性抗原第四结构域,为利用人抗体库进行筛选抗炭疽毒素的人源性中和抗体奠定了基础。     

RanBPM的结构和功能

RanBPM是Ran蛋白在微管组织中心的结合蛋白。RanBPM包含5个结构域,分别是氨基端的脯氨酸结构域、SPRY结构域、LiSH结构域、CTLH结构域和CRA结构域。其中SPRY结构域和CRA结构域介导RanBPM与其它蛋白质间相互作用。RanBPM能与众多蛋白质相互作用,因而被认为是脚手架蛋白(scaffolding protein),它和几种受体蛋白相互作用后参与了细胞内多种信号转导途径。RanBPM能与细胞周期相关蛋白相互作用,调节细胞周期,它还参与了免疫系统、生殖系统和神经系统的调节。此外,RanBPM还能抑制蛋白质泛素化,是一个肿瘤细胞的抑制因子。     

蛋白质PX结构域的结构和功能

本文重点介绍了近年不断发现的许多蛋白质结构中含有一个特异的结构域（hox homolog)－PX结构域。蛋白质通过PX结构域与膜肌醇磷脂结合靶蛋白质结合到细胞膜上,然后发挥蛋白质的各自功能。现已鉴定含PX结构域的蛋白质约有100多种,这些蛋白质参与蛋白质转运和信号转导。     

炭疽毒素的细胞受体

炭疽杆菌外毒素是三组分蛋白质,构成两种毒素。水肿因子(EF)和致死因子(LF)分别是腺苷环化酶和金属蛋白酶,保护性抗原(PA)与细胞表面受体结合并将水肿因子或致死因子转移进细胞内发挥毒性作用。在哺乳动物细胞上己发现有两种受体,分别是肿瘤内皮标志8基因编码的细胞表面蛋白ATR／TEM8和毛细血管形态发生基因2编码的细胞表面蛋白CMG2。这两种受体蛋白的生理功能都不十分清楚,它们之间的氨基酸序列有很高的同源性(40％～60％)。氨基酸序列主要分信号肽、细胞外主基、跨膜区、脑浆尾四个区,细胞外主基内含von WIlle-brand因子A主基或称整合素插入主基(VWA／I主基),VWA／I主基内有金属离子依赖性粘连位点(MIDAS),是主基与PA蛋白质相互作用所必不可少的。这两种受体都有几种异构体,主要差异在于胞浆尾区的氨基酸长度不同。两种VWA／I主基都有封闭PA功能,阻止细胞中毒的作用,有望作为抗毒素治疗炭疽。     

双链RNA结合蛋白与双链RNA结合域

双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)能引发细胞的抗病毒机制,其产生效应是因为作用于含有dsRNA结合域(dsRNA·binding domain,DRBD)的酶类和其他功能蛋白质,这些蛋白质能够特异性地识别并结合dsRNA,从而引起细胞应答.已有的资料表明DRBD不仅与dsRNA结合,还能与DNA或其他形式的RNA分子结合,而且有些蛋白质的DRBD不与任何核酸分子结合,仅起调节作用.另外,同种蛋白质的不同DRBD之间以及不同蛋白质的DRBD之间也能相互作用,从而形成复杂的蛋白质一蛋白质复合体,参与多种细胞代谢途径.因此,DRBD及其含有这些结构域的蛋白质可能具有多种功能.     

锚蛋白重复序列介导的蛋白质-蛋白质相互作用

锚蛋白重复序列(ANK)是生物体中广泛利用的一种序列模体.ANK模体在ANK结构域中折叠成β₂α₂结构,在空间上则形成L型结构.数目不等的ANK串联起来, 依靠氢键和疏水相互作用,组成紧密、稳定的结构域,并且形成了种类众多但功能各异的ANK蛋白质分子.ANK结构域介导蛋白质与蛋白质的相互作用,它能够和多种配体结合,实现纷繁复杂的生物功能.着重介绍几类结构已知的ANK家族蛋白质分子及复合物的结构特征、生理功能及与疾病的关系.     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性片段包含三个不同的结构域。通过对毒性片段编码基因的定点诱变和体外重组,已经对结构域的功能有了较清晰的认识。一般认为结构域Ⅰ参与孔道的形成,结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合,结合域Ⅲ主要调节毒素的活性。本文根据国外研究,从毒素蛋白质结构的不同组织层次、阐述了这些区域的结构与其功能的关系。     

锌指蛋白的设计及其应用

人工设计的锌指蛋白一般包括两个结构域：DNA结合结构域和效应结构域。DNA结合结构域主要采用对DNA序列特异性识别结合的C2H2型锌指结构域,而功能结构域常常采用某些转录激活结构域、转录抑制结构域或某些酶的活性结构域。这样进行设计的锌指蛋白就可以在特定的核酸序列上行使相应的功能,这对于目的基因的表达调控及蛋白质与核酸的相互作用研究提供了新的思路。     

鲫鱼PKR-like Zα与d(GC)13质粒的结合及其适应性进化

Zα是一类能特异性识别与结合左旋DNA(Z-DNA)的蛋白质结构域,分布于不同物种的多种蛋白质中,其结构保守并分化自一个共同的祖先Z-结构域.适应性进化分析显示Zα没有经历正达尔文选择,表明与其结构对应Zα的功能相当保守.凝胶阻滞试验表明原核表达的鲫鱼PKR-like Zα多肽(CaPZα)与pMD18-T质粒结合,而却能与包含d(GC)13的重组质粒pMD18-T/(GC)13结合.同时,与ADARl Zα相比,CaPZα与d(GC)13质粒的结合能力较弱,即CaPZα1和CaPZα2子域单独不能结合d(GC)13质粒.这表明Zα功能虽然没有异化,但有很大的不同.实验结果还表明负超螺旋和d(GC)n可能都是正常生理条件下,DNA形成潜在Z-DNA必不可少的因素.定点突变试验证实38N与60W两个氨基酸位点对于CaPZα结合Z-DNA非常关键.     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性片段包含三个不同的结构域,通过对毒性片段编码基因的定点诱变和体外重组,已经对结构域的功能有了较清晰的认识,一般认为结构域Ⅰ参与孔道的形成,结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合,结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。本文根据国外研究,从毒素蛋白质结构的不同组织层次,阐述了这些区域的结构与其功能的关系。