苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体65kD原毒素的质谱分析

以苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体65kD原毒素为材料,探索了从SDS－PAGE胶上回收蛋白质进行质谱分析的方法。蛋白纯化的步骤包括SDS－PAGE、电洗脱、脱盐、除SDS。电洗脱采用半透膜法,用超滤法脱盐,冷丙酮沉淀法除去SDS。结果表明,纯化的65kD原毒素经ESI－MS检测,分子量约64500Da。经MALDI－MS检测,未能有明显蛋白峰出现,这可能是该蛋白由于较强的疏水作用,溶解性差,在与基质混合时处于聚和悬浮态所致。     

植酸酶分子结构与功能研究进展

根据植酸酶的最新研究进展,综述了植酸酶的分子结构与空间构象,作用机制和对植酸降解的途径及其在酶学和蛋白质组学中的地位,并且对植酸酶今后研究发展方向作一探讨。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用

苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性片段包含三个不同的结构域。通过对毒性片段编码基因的定点诱变和体外重组 ,已经对结构域的功能有了较清晰的认识。一般认为结构域Ⅰ参与孔道的形成 ,结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合 ,结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。本文根据国外研究 ,从毒素蛋白质结构的不同组织层次 ,阐述了这些区域的结构与其功能的关系。     

苏云金芽胞杆菌Bt0601发酵条件的优化研究

应用正交实验和单因子实验,结合杀虫毒力测定,对携带杀虫基因cry1Ac和虎纹捕鸟蛛毒素基因Hwtx-I的苏云金芽胞杆菌工程菌Bt 0601的发酵工艺条件进行研究。实验获得的苏云金芽胞杆菌Bt 0601工程菌的最佳发酵条件为:发酵初始酸碱度控制在pH 7.5、发酵温度(30±0.5)℃、转速200 r/min、通气量为30 mL/300 mL,接种量为4%,培养44 h。此外,本文还对Bt 0601菌株在30 L发酵罐中的发酵特性进行了研究,摸索了通气量对其大罐发酵的影响,确定大罐发酵的最佳通气量为1.75 L/min。     

降解烟碱的YC-68菌株16SrDNA序列分析及鉴定

从烟叶调制过程中温度达68℃阶段的叶片上分离得到一株能降解烟碱的菌株,编号为YC-68,该菌经常规的形态、生理生化分析,确定为芽孢杆菌。根据该菌16 S rDNA恒定区的保守性设计了一对通用引物,扩增其16 S rDNA序列,将扩增的产物进行回收后进行测序,把测序后的结果提交到GenBank利用BLAST进行序列同源性分析。经过分析鉴定YC-68菌株为芽孢杆菌属的蜡状芽孢杆菌。     

苏云金杆菌Bt0601菌株发酵培养基的优化

运用正交试验L18(37)设计对携带杀虫基因cry1Ac和虎纹捕鸟蛛毒素基因hwtx-Ⅰ的苏云金杆菌工程菌Bt0601的发酵培养基进行了优化研究.试验获得的最佳优化复合培养基配方为(%)玉米粉1.0,黄豆饼粉0.50,酵母膏0.15,蛋白胨0.05,磷酸二氢钾0.75,碳酸钙0.05,硫酸镁0.035.Bt0601在该优化培养基下发酵,48 h每mL发酵液产芽孢11.4×109个,伴孢晶体23.0×107个,对3龄小菜蛾(Plutella xylostella)48 h的致死率达96.7%.普通发酵培养基下相应的芽孢产量为9.33×109个,伴孢晶体9.57×107个,毒力为68.5%.     

产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究

通过初筛和复筛,得到一株产植酸酶较高的黑曲霉AN00101菌株,并对该菌种的产酶条件进行了研究.结果表明:配制加水量为35%的麸皮固体培养基,在37℃培养114h,用3%CaCl2进行提取,每g固体发酵物酶活高达1.3×104IU.经L9(34)正交实验表明,硫酸铵和硫酸镁对产酶有显著的促进作用,适宜添加量分别为4%和0.3%.     

营养因子对苏云金芽胞杆菌4.0718 产杀虫蛋白Cry1和Cry2的影响

为了提高杀虫蛋白Cry1和Cry2产量,首先采用Plackett-Burman设计筛选出发酵培养基中影响苏云金芽胞杆菌4.0718表达毒蛋白Cry1的显著性因子为黄豆饼粉和MnSO4·H2O,Cry2的产量在该配方中无显著性影响因子.然后利用最速上升实验逼近Cry1最大产出区域,找到后续试验中心点.最后通过响应面优化得到黄豆饼粉和MnSO4·H2O的最佳浓度为11.5 g/L和0.02 g/L,使Cry1和Cry2产量分别达到0.32 mg/mL和0.11 mg/mL,比原优选配方产量提高了两倍多.该优化配方发酵液对棉铃虫的半致死浓度(LC50)为1.09 μL/mL,杀虫活性比原优化配方显著提高.     

苏云金芽孢杆菌4.0718菌株的杀虫晶体蛋白基因分析

根据苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)cry1、cry2和cry3型基因的保守区分别设计了3对通用引物Un1(d)/Un1?、Un2(d)/Un2?和Un3(d)/Un3?,以Bt4.0718菌株质粒DNA为模板进行PCR扩增,通过扩增产物片段的分子量大小来确定该菌株所含有的杀虫晶体蛋白基因类型。随后根据上述3类cry基因的高变区设计特异引物再次进行PCR鉴定。结果表明:Bt4.0718菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Cb、cry2Ac和新基因cry4.5等6种基因类型。这一结果为利用该菌株构建高效广谱杀虫工程菌提供了客观依据。