鱼类eIF2α激酶PKR和PKZ研究进展

PKR和PKZ是eIF2α激酶家族中2个重要的成员。由于其特殊的进化地位,鱼类具有一些自身特有的免疫因子和免疫机制。研究发现,斑马鱼、鲫鱼和草鱼的基因组中同时存在PKR和PKZ,其结构与功能既相似又不同。在细胞中,PKR是一种ds RNA受体,PKZ为一个Z-DNA/Z-RNA识别受体,它们都可能对病毒侵染产生应答。在病毒侵入鱼类细胞时,PKR和PKZ有功能的重叠,但也有作用机制的分化。     

鲫鱼PKZ Zα结构域与d(GC)、d(TA)重组质粒的结合

Zα是能够特异性识别并结合左旋DNA(Z-DNA)的蛋白结构域,首先在人ADAR1中鉴定,随后又在ZBP-1(DLM-1)和E3L等蛋白质中发现了该结构域．鲫鱼PKZ是首次报道的具有Zα结构域的鱼类eIF2α激酶．为深入了解鲫鱼PKZ Zα的功能,原核表达并亲和层析纯化了3种多肽,即野生型PZα(Zα1Zα2)、替换型P(Zα1)2(Zα1Zα1)和点突变型（PZαK34A、PZαS35A、PZαR39A、PZαP57A）．同时,构建了含有d(GC)6、d(GC)13、d(TA)13特殊插入序列的3种重组质粒,用于体外模拟Z-DNA．凝胶阻滞实验分析了3种多肽分别与重组质粒的亲和性结果表明,PZα和P(Zα1)2能够与d(GC)重组质粒结合,并且随着多肽含量的增加,阻滞效应越明显．与野生型PZα相比,替换型P(Zα1)2结合d(GC)重组质粒的能力更强PZα和P(Zα1)2还能微弱地与d(TA)13重组质粒结合．点突变型多肽都不能与重组质粒结合,暗示鲫鱼PKZ Zα结构域中这4个氨基酸残基在结合核酸分子的过程中非常关键．该文结果有利于进一步揭示鱼类PKZ Zα结构域与Z-DNA结合的分子机理．     

鲫鱼PKR-like Zα与d(GC)13质粒的结合及其适应性进化

Zα是一类能特异性识别与结合左旋DNA(Z-DNA)的蛋白质结构域,分布于不同物种的多种蛋白质中,其结构保守并分化自一个共同的祖先Z-结构域.适应性进化分析显示Zα没有经历正达尔文选择,表明与其结构对应Zα的功能相当保守.凝胶阻滞试验表明原核表达的鲫鱼PKR-like Zα多肽(CaPZα)与pMD18-T质粒结合,而却能与包含d(GC)13的重组质粒pMD18-T/(GC)13结合.同时,与ADARl Zα相比,CaPZα与d(GC)13质粒的结合能力较弱,即CaPZα1和CaPZα2子域单独不能结合d(GC)13质粒.这表明Zα功能虽然没有异化,但有很大的不同.实验结果还表明负超螺旋和d(GC)n可能都是正常生理条件下,DNA形成潜在Z-DNA必不可少的因素.定点突变试验证实38N与60W两个氨基酸位点对于CaPZα结合Z-DNA非常关键.     

草鱼穿孔素C端溶细胞活性分析

穿孔素的溶细胞作用是机体杀伤病毒和其他微生物感染细胞以及肿瘤细胞的一种效应机制。穿孔素在鱼类非特异性免疫中起重要作用。为了解鱼类穿孔素的功能,根据穿孔素基因序列特征,在已构建的草鱼肝肾cDNA文库中克隆了草鱼穿孔素基因C端包含1个完整蛋白激酶C保守结构域(C2)的cDNA。将该cDNA与表达载体pET32a连接并转化表达菌DE3,诱导表达。His-Bind亲和柱纯化获得了草鱼穿孔素C端表达多肽(PFP-C)。将PFP-C与兔红细胞共育,结果表明：PFP-C具有溶血功能,且在pH 7.5时活性最大,其溶血活性对Ca2+有明显的依赖性。     

Z-DNA的形成及其与基因转录的关系

Z-DNA是一种非常独特的DNA二级结构.与B-DNA相比,Z-DNA最显著的结构特征是左手螺旋和磷酸-核糖骨架呈“zigzag”状. 虽然目前对Z-DNA功能的了解还不确切,但毫无疑问,Z-DNA与基因的转录和调控密切相关. 一方面,在体内Z-DNA在基因转录过程中产生;另一方面,分布于启动子等不同区域的Z-DNA又可以反过来调控基因的转录, 即Z-DNA能够增强一些基因转录,也能抑制某些基因的表达,但其调控机制还不清楚.这种调控似乎与Z-DNA在启动子中的位置、基因和细胞类型有关.研究Z-DNA的形成及其与基因转录的关系对理解基因转录调控理论具有十分重要的意义.     

AFLP分析江西省4个斑点叉尾鮰养殖群体遗传多样性

本文运用AFLP分子标记技术,对江西省4个斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)养殖群体(GZ、XJ、PYA和PYB)进行遗传多样性分析。结果表明,在64对引物组合中,E3/M2、E4/M7、E3/M8和E5/M5引物从4个群体72个体中共扩增出179个位点,其中多态位点为109,占60.89%。其中,PYA、GZ、XJ和PYB群体的多态位点比例(P)分别为56.54%、56.47%、56.32%和56.14%。Shannon多样性指数(I)分别为0.2890、0.3003、0.2896和0.2852,平均杂合度(H)分别为0.1935、0.2027、0.1938和0.1898。4个群体间的遗传分化系数(Gst)为0.1314,说明群体间发生了一定程度的遗传分化,但分子方差分析(AMOVA)显示,群体的遗传变异90.98%来源于群体内的个体间,9.02%来源于群体间。聚类分析也表明,4个群体所产生的遗传分化主要也来源于群体内。本研究为斑点叉尾鮰种质资源的调查和保护提供参考,为斑点叉尾鮰优良品种的选育提供科学依据。     

痘苗病毒E3L蛋白的结构与功能

E3L蛋白是痘苗病毒基因组所编码的一种非常重要的毒力蛋白。E3L结构高度保守,其N端为Z-DNA结合域(Zα),C端为双链RNA结合域(dsRBM),两者均为其致病性所必需。E3L具有抵御宿主细胞干扰素及其诱导蛋白的抗病毒作用,以及抑制细胞凋亡、抵抗RNA干扰等多方面的重要功能,这些策略有助于逃避宿主的抗病毒免疫。     

草鱼Annexin A4基因克隆、表达特性及进化

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Annexin A4基因克隆于肝肾cDNA文库,该cDNA全长为1307bp,其中,5′非编码区为104bp,3′非编码区为237bp,开放阅读框为966bp,编码321个氨基酸。草鱼Annexin A4编码的蛋白质N端由15个氨基酸残基组成,C端具有4个重复序列,每个重复序列都有一个Ⅱ型钙结合位点,在第4个钙结合位点中包含一个"KGD"序列。Annexin A4在草鱼肝、肾、脾、心、鳃、肠中的表达量均较高,而肌肉和脑中不表达;PolyⅠ:C诱导后,其表达均有所下调。系统发育树显示,草鱼Annexin A4与斑马鱼(Danio rerio)的进化距离最近。适应性进化分析没有检测到正选择位点,表明Annexin A4非常保守,受到强烈的功能约束。