Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的表达纯化及初步鉴定

目的:构建Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,纯化得到具有生物学活性的目的蛋白。方法:首先从合成的pUC57-CBLB502质粒中扩增出CBLB502基因片段,酶切后克隆至pUC57-Fc质粒中,然后双酶切pc DNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc,将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体pc DNA3.1,挑选阳性克隆并测序,再将重组质粒转染CHO细胞,筛选高表达细胞系,用免疫印迹鉴定表达情况,Protein A亲和柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,用小鼠辐射试验初步验证目的蛋白的生物学活性。结果:构建了pc DNA3.1-CBLB502-Fc真核表达载体;转染CHO细胞,筛选得到CBLB502-Fc高表达细胞系,并经免疫印迹鉴定培养上清;纯化得到较高纯度的融合蛋白并经SDS-PAGE鉴定;小鼠辐射实验表明CBLB502-Fc具有抗辐射作用。结论:真核表达并纯化了具有抗辐射作用CBLB502-Fc融合蛋白,为后续研究CBLB502-Fc的生物学功能奠定了重要基础。     

抗 CD20融合蛋白在 CHO 细胞中的表达及其纯化与鉴定

目的：构建CD20胞外区与Igβ胞外区和人IgG1 Fc融合基因的表达载体,并在CHO细胞中表达。方法与结果：根据已知的IgM的CH2区域和Igp胞外区序列,分别设计PCR引物并进行PCR扩增,然后用重叠PCR法扩增得到900bp的Igp-CH2序列,插入本实验室构建的pIRIS-EGFP-Fc载体,转化大肠杆菌,得到pIRIS-Igβ-CH2-Fc重组质粒,将其转染CHO-K1细胞,在G418抗性培养基中培养,荧光显微镜观察结合ELISA法筛选高表达细胞系,细胞系扩大培养后,通过亲和层析rProteinA柱纯化得到纯度融合蛋白,SDS-PAGE显示目的蛋白去糖基化后,相对分子质量约为42×10^3。结论：得到了Igβ-CH2-Fc重链抗体样分子,并鉴定为糖蛋白;须进一步对所得蛋白的生物学活性进行检测,验证其是否能够通过胞外区蛋白定位于B细胞淋巴瘤细胞表面对B淋巴瘤细胞进行杀伤。     

人IL35-IgG4(Fc)融合蛋白在CHO/DG44细胞中的稳定表达

本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体, 稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)诱导的人髓性白血病细胞株KG-I cDNA文库中克隆EBI3和IL-12p35 cDNA, 重叠PCR法连接2个片段, 并克隆到IgG4(Fc)- pOptiVEC?-TOPO?载体上,对新构建的IL-35-IgG4 (Fc) pOptiVEC?-TOPO?真核表达载体并进行酶切、测序、PCR鉴定; 脂质体法转染CHO/DG44细胞; RT-PCR检测转染结果, 采用a-MEM-培养基筛选实验组细胞, 对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤(Methotrexate, MTX)的加压筛选, ProteinG-Agarose纯化阳性克隆培养上清, 免疫印迹检测目的蛋白表达。结果显示IL-35-IgG4 (Fc) pOptiVEC?-TOPO?表达载体稳定转染CHO/DG44细胞并获得阳性克隆; SDS-PAGE电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带; 该蛋白能与羊抗人IgG4抗体特异结合。本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的IL35-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞株。     

hTNFRII-Fc融合基因的克隆及在CHO细胞中的表达

构建人肿瘤坏死因子受体II胞外区（TNFRII）和人免疫球蛋白（IgG1）Fc段的融合基因真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达融合蛋白hTNFRII-Fc。用全合成重叠延伸PCR方法克隆TNFRII胞外区的基因片段,再与（IgG1）Fc段拼接起来形成hTNFRII-Fc融合基因,经HindIII、EcoRI双酶切后插入至pEE14中构建pEE14-TNFRII-Fc真核表达载体,脂质体转染至CHO细胞中进行表达及鉴定。ELISA检测到转染hTNFRII-Fc基因的CHO细胞培养上清中含有hTNFRII-Fc蛋白,SDS-PAGE与Western-blot鉴定证实其为hTNFRII-Fc蛋白,为进一步研究该融合蛋白在CHO细胞稳定表达及应用于类风湿关节炎等自身免疫性疾病临床治疗奠定了一定的研究基础。     

重组中东呼吸综合征病毒刺突蛋白S1亚基及其编码DNA接种小鼠的抗血清水平研究

人工合成了大小为2 253 bp刺突蛋白的S1亚基的基因片段,构建了含有中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白S1亚单位(MERS-Co V S1)编码基因的重组表达质粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc,转染重组质粒至HEK293E细胞后,筛选出了可稳定表达重组融合蛋白的阳性克隆细胞株,进行了刺突蛋白亚单位融合蛋白(S1-Fc)的重组表达和纯化,获得了大小约为122 kD的重组S1-Fc融合蛋白,Western blotting验证重组蛋白为目的蛋白;将重组质粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc、重组S1-Fc融合蛋白以及Peak13CD5LS1TEVhIgGFc联合S1-Fc融合蛋白分别接种小鼠,以纯化的重组S1-Fc融合蛋白作为抗原,利用Western blotting及ELISA分别检测了小鼠的抗S1血清滴度及特异性。结果发现,3种方法接种的小鼠中均存在特异性抗S1血清。其中,接种重组S1-Fc融合蛋白和接种S1-Fc融合蛋白联合重组质粒的小鼠在首次接种就产生高滴度抗S1血清,而只接种重组质粒的小鼠在3次接种后才产生了特异性抗S1血清。两种含重组S1-Fc融合蛋白的接种方法诱导小鼠产生的抗S1血清滴度基本一致,均显著高于仅接种重组质粒的小鼠的抗S1血清,证明短期内重组S1-Fc蛋白接种更快速高效。     

人CS1-Fc融合蛋白的真核表达、蛋白纯化及生物学效应鉴定

人信号淋巴细胞激活分子F7 (SLAMF7/CS1)是一种细胞表面糖蛋白,在多发性骨髓瘤细胞中高度表达。已有研究表明CS1是多发性骨髓瘤较为灵敏且特异的生物标志物。CAR-T细胞免疫疗法是治疗多发性骨髓瘤的新方法,其中CS1 CAR-T细胞免疫疗法针对复发性难治性多发性骨髓瘤有较好的疗效。为了检测CS1 CAR-T细胞上CS1CAR的表达效率和探寻CAR-T细胞免疫疗法的辅助手段,文中制备了一种CS1-Fc融合蛋白。首先利用PCR技术从已有质粒中扩增得到CS1的胞外段序列,再通过重叠延伸PCR与人IgG1-Fc段相连。将重组片段连接至pMH3真核表达载体上,经酶切鉴定和DNA测序后,将重组质粒pMH3-CS1-Fc-his转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S)。经G418加压筛选和流式细胞术鉴定,证实CS1-Fc融合蛋白在CHO-S细胞中获得了表达。利用镍柱对CS1-Fc融合蛋白进行纯化,经Western blotting鉴定,融合蛋白的分子量约为70 kDa。流式细胞术和细胞计数分析结果显示,CS1-Fc融合蛋白能有效检测CS1 CAR的表达效率,证实了CS1-Fc融合蛋白对CS1 CAR-T细胞具有活化、促增殖及促分泌细胞因子的作用。本研究结果为多发性骨髓瘤细胞免疫治疗CAR-T细胞的体外检测和效能强化奠定了实验基础。     

炭疽受体CMG2-Fc 融合蛋白在CHO 细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:构建炭疽受体CMG2和人IgG1 Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素(PA+LF)的能力。方法:将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgG1的Fc片段基因共同连接入pcDNA3.1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264.7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果:获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论:CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western印迹检测蛋白表达.结果 pEGFP-Hoxa11重组质粒构建成功.构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11能在CHO细胞中有效表达.结论 成功构建了共表达Hoxa11和EGFP的真核表达载体,并能在CHO细胞中有效表达.为进一步研究Hoxa11的功能提供实验基础.     

尘螨变应原Der f1 真核表达载体的构建及转染CHO 细胞

目的:构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-hisA上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定.结果:将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株.结论:成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质.     

炭疽受体CMG2-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达、纯化与鉴定

目的：构建炭疽受体CMG2和人IgGl Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素（PA＋LF）的能力。方法-将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgGl的Fc片段基因共同连接入pcDNA3．1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264．7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果：获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论：CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。     

CTLA4Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达

CTLA4Ig是人CTLA4胞外区与人免疫球蛋白铰链区、CH2区、CH3区组成的融合蛋白,可以与B7结合,通过阻断B7与CD28的结合,从而阻断B7介导的T细胞活化必需的共刺激信号,可作为免疫抑制剂用于器官移植。将CTLA4Ig融合分子克隆到真核表达载体pCI-dhfr,并用脂质体方法转染到COS7和CHO-dhfr-细胞中,用氨甲喋呤筛选转染的CHO-dhfr-细胞。用RT-PCR、ELISA、细胞免疫荧光染色和Western-blot鉴定重组蛋白的表达。采用A蛋白纯化重组蛋白。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。     

Recovery of choline oxidase activity by in vitro recombination of individual segments

Elevated levels of B cell-activating factor of the TNF family (BlyS) have been implicated in the pathogenesis of autoimmune diseases in human. Removal of pathogenic B lymphocytes by decoy receptors has demonstrated clinical benefit in both oncological and immunological diseases. In this report, we have constructed vectors for the convenient and rapid expression of the extracellular domain of BR3(sBR3) fused to the Fc fragment (hinge, CH2, CH3) of human IgG1 in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. SDS-PAGE assays of culture broth from a methanol-induced expression strain demonstrated that the recombinant sBR3-Fc fusion protein is secreted and recovered from the culture medium as a disulfide-linked, glycosylated homodimer. The recombinant protein was purified to >95% using protein A affinity chromatography and size exclusion chromatography steps. Bioactivity of the recombinant sBR3-Fc was confirmed by the ability of the protein to inhibit mouse B lymphocyte proliferation induced by BLyS in vitro. Our results suggest that the P. pastoris expression system can be used to produce large quantities of fully functional sBR3-Fc fusion protein for both research and industrial purposes.     

BLyS受体TACI、BCMA与人IgG1 Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达与鉴定

从人肝脏和肾脏cDNA文库中扩增了人IgG1Fc与B淋巴细胞刺激因子 (BLyS)的受体TACI及BCMA的胞外编码区 ,构建了TACI Fc及BCMA Fc融合表达质粒pSec1 Fc TACI与 pSec1 Fc BCMA ,并使用电穿孔法转染COS 7细胞 ,从 1L无血清培养上清中可纯化得到分泌表达的TACI Fc与BCMA Fc融合蛋白约 2mg。为获得TACI Fc与BCMA Fc的稳定来源 ,构建了TACI Fc与BCMA Fc的CHO稳定表达细胞株。免疫沉淀和ELISA结果显示 ,TACI Fc及BCMA Fc能特异性地结合其配体BLyS而不与BLyS同家族的TNF结合。TACI Fc及BCMA Fc可阻断BLyS对体外培养的小鼠B淋巴细胞的促增殖作用     

Expression of a recombinant chimeric protein of hepatitis A virus VP1-Fc using a replicating vector based on Beet curly top virus in tobacco leaves and its immunogenicity in mice

We describe the expression and immunogenicity of a recombinant chimeric protein (HAV VP1-Fc) consisting of human hepatitis A virus VP1 and an Fc antibody fragment using a replicating vector based on Beet curly top virus (BCTV) in Agrobacterium-infiltrated Nicotiana benthamiana leaves. Recombinant HAV VP1-Fc was expressed with a molecular mass of approximately 68?kDa. Recombinant HAV VP1-Fc, purified using Protein A Sepharose affinity chromatography, elicited production of specific IgG antibodies in the serum after intraperitoneal immunization. Following vaccination with recombinant HAV VP1-Fc protein, expressions of IFN-γ and IL-4 were increased in splenocytes at the time of sacrifice. Recombinant VP1-Fc from infiltrated tobacco plants can be used as an effective experimental immunogen for research into vaccine development.     

Patterning Axonal Guidance Molecules Using a Novel Strategy for Microcontact Printing

We present here a two-step strategy for micropatterning proteins on a substrate to control neurite growth in culture. First, conventional microcontact printing is used to prepare a micropattern of protein A, which binds the Fc fragment of immunoglobulins. Then, a chimeric protein, consisting of the extracellular domain of a guidance protein recombinantly linked to the Fc fragment of IgG (prepared using conventional molecular techniques), is applied from solution. The chimeric protein binds to the patterned protein A, taking on its geometric pattern. Using this method, we have micropatterned the extracellular domain of the cell adhesion molecule, L1 (as an L1-Fc chimera) and demonstrated that it retains its ability to selectively guide axonal growth. L1-Fc micropatterned on a background of poly-l-lysine resulted in selective growth of the axons on the micropattern, whereas the somata and dendrites were unresponsive. Substrates bearing simultaneous micropatterns of L1-Fc and poly-l-lysine on a background of untreated glass were also created. Using this approach, cell body position was controlled by manipulating the dimensions of the poly-l-lysine pattern, and the dendrites were constrained to the poly-l-lysine pattern, while the axons grew preferentially on L1-Fc. The two-step microcontact printing method allows preparation of substrates that contain guidance proteins in geometric patterns with resolution of 1 m. This method should be broadly applicable to many classes of proteins.