衣藻培养及其硝酸还原酶活力的测定

本文通过提高培养基的pH和磷酸盐浓度解决了衣藻在硝酸盐培养基上生长不良的问题。用完全合成培养基代替土壤提取液培养基。用钼酸钠和氯化钙代替钼酸铵和硝酸钙,消除了培养基中影响硝酸还原酶(NR)诱导的因素。用单藻落繁殖的保种方法保持了NR的诱导特性。在酶反应后用乙酸锌和甲硫吩嗪处理,去除了反应过剩的NADH和衣藻粗提取液中的某些物质对亚硝酸显色反应的抑制,建立了满意的NR活力测定技术。     

马铃薯培养基对粳稻花培效应及其应用研究

在以往研究的基础上,近年来我们又对马铃薯培养基的研制和使用效果作了进一步探讨。其主要结果为:1、马铃薯提取液对花药诱导愈伤组织的效果:用20%马铃薯提取液分别取代 B 培养基的大量元素、有机成分与微量无索并以 B 培养基为对照,其结果分别为10.92%、9.50%和10.50%,相差不大。2、不同浓度提取液的马铃薯培养基的诱导效果:5%的     

农杆菌介导转化莱茵衣藻体系的优化

为建立根癌农杆菌介导的莱茵衣藻快速简便高效的遗传转化体系,本研究以模式生物莱茵衣藻为受体材料,从转化方法和转化子快速鉴定两个方面进行了优化。[方法]比较了固体培养基共培养转化方法和液体培养基共培养转化方法对根癌农杆菌LBA 4404介导的莱茵衣藻CC425转化效率的影响;研究并比较了(1)首先经过TE裂解再进行PCR(两步法)和(2)不经TE裂解直接进行PCR(一步法)的两种转化子鉴定方法的最佳反应条件和扩增效率。[结果]农杆菌LBA 4404和莱茵衣藻CC425液体培养基共培养5 d后的转化效果最好,转化率达43.33±1.67个转化子/10⁶个藻细胞。PCR最佳反应条件为:使用高保真DNA聚合酶Taq 1进行扩增;参加PCR反应的细胞密度为5×10³-5×10⁶个/mL;TE裂解缓冲液沸水浴20 min(两步直接PCR方法),或者预变性15 min(一步直接PCR方法)。两步法直接PCR的扩增效率优于一步法,但后者反应步骤更简洁。[结论]本研究建立并优化了农杆菌液体介导莱茵衣藻遗传转化体系,该体系可快速获得遗传转化子,减少转化工作量。     

转基因衣藻lba及对照藻产氢培养条件的优化

通过对莱茵衣藻849及其转基因衣藻lba进行光照强度、细胞浓度和培养基中硫酸盐含量三因素三水平的正交实验,确定了两个藻种的最佳产氢条件,同时对转基因藻和849产氢培养条件下的光合放氧速率和pH进行了检测。实验结果表明,在25 ℃下,莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最佳产氢条件都为光照强度 60μmol/(m²·s),细胞浓度为叶绿素含量12.5μg/ml,培养基中硫酸盐含量0μmol/L。莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最高氢气产量分别达到了349μl/mg chlorophyll 和634μl/mg chlorophyll。在产氢条件下,转基因藻lba的净光合放氧速率比849低。结果为利用豆血红蛋白特性通过基因工程手段提高莱茵衣藻产氢量提供基础实验数据。     

叶绿体陪伴蛋白在几种藻类中的存在和分布

用豌豆叶绿体陪伴蛋白（ｃｈ－ｃｐｎ６０）的杭体对衣藻和多种蓝藻细胞提取液作Ｗｅｓｔ－ｅｒｎｂｌｏｔ分析表明：真核的衣藻和原核的有异形胞丝状蓝藻的一种鱼腥藻中存在一种与豌豆ｃｈ－ｃｐｎ６０抗体有交叉反应的蛋白,其一个亚基的分子量与豌豆该蛋白的分子量相似,而另一亚基的分子量高于豌豆的β亚基分子量。绿藻和丝状蓝藻中这一蛋白在热处理后含量增加,而经－２０℃冷处理１２ｈ后含量明显下降。在单细胞蓝藻中则检测不到这种蛋白。     

衣藻细胞玻璃化超低温保存技术的研究

本研究以衣藻为材料,探讨其玻璃化超低温保存的条件和方法,结果表明,衣藻经含0.25mol/L蔗糖溶液的TAP培养基预培养一天后,在玻璃化冷冻保护剂中脱水5分钟,直接投稿液氮,48小时后快速化冻,去保护剂并用含0.5mol/L蔗糖溶液的TAP培养基境培养一天,再转到ATP培养基暗培养一天,最后置光照条件下恢复培养,其存活率可达31.45％,恢复培养后衣藻细胞的生长规律与未冻存的衣藻相一致。     

衣藻生物制氢的研究进展

综述了利用衣藻生产氢气作为再生能源的研究进展。分别介绍了衣藻产氢的代谢机理、培养条件、衣藻氢化酶的特性以及利用分子生物学手段、生物信息学手段和生物工程技术提高衣藻生物制氢效率的方法,包括氢化酶的氧耐受性的改造、外源氢化酶基因的表达、影响衣藻产氢的关键基因的筛选、利用缺硫培养基和固定化培养方法提高氢气产量等。最后,还对利用衣藻生物制氢的可行性和经济性进行了分析,对其发展方向提出自己的看法。     

硝酸还原酶的研究——Ⅱ.6-BA和光对小麦硝酸还原酶诱导的影响

黄化麦苗在暗中不能由NO_2~-诱导产生NR,而生长在水中的黄化麦苗经6小时以上的预照光,则可在随后的暗期中由NO_3~-诱导产生高活性的NR。白光、红光和远红光的短暂照光,不能使麦苗获得在暗中由NO_3~-诱导高活性NR的能力。无论在诱导介质或非诱导介质中,这种诱导能力在暗中都逐渐消失。DCMU可部分抑制黄化麦苗NR的光下诱导。预照光后植株的NR暗诱导被砷酸钠抑制。葡萄糖能促进离体黄化叶片在暗中诱导形成高于对照的酶活性。预照光通过光合产物为NR合成提供能量,可能是使麦苗能在暗中诱导NR的原因之一。6-BA可促进麦苗NR诱导。单独6-BA对NR无明显诱导作用,但它可明显促进NO_3~-对酶的诱导。NO_3~-、NO_3~-和6-BA的诱导作用均受环己酰亚胺抑制。6-BA缩短了NR诱导的滞后期,6-BA对NR诱导的促进紧密平行于它对叶绿素积累的促进。而光合作用影响NR的诱导,6-BA缩短NR诱导滞后期可能与6-BA加快叶绿体的发育,促进光合作用之间存在着紧密的联系。     

谷氨酸废液培养莱茵衣藻的产氢研究

通过在一般培养基中添加尿素、谷氨酸、葡萄糖等有机物,考察了菜茵衣藻混合营养培养的产氢效果。结果表明,含尿素混合营养培养菜茵衣藻产氢是含铵氮的培养基培养的6倍,无硫含尿素的混合营养培养具有最佳的产氢效果,是有硫含铵氮的培养基的10倍。谷氨酸及葡萄糖的添加对其生长和产氢也有促进作用,对菜茵衣藻生长和产氢促进作用的尿素的最佳添加量为0．25g/L,谷氨酸的最佳添加量为0．7g/L,葡萄糖的添加量为0．2g/L。     

青霉素对草莓组培苗硝酸还原酶活性的影响

本实验利用植物组织培养的方法,在基本培养基中添加不同浓度的青霉紊对草莓进行根的诱导,以测定植株的 NR 活性。结果表明:实验剂量范围内,其 NR 活性随青霉素浓度增加呈正相关,同时发现草莓体内 NR 主要存在于地上部分。本实验设两个处理:MS 青霉素50mg/1;MS 青霉素100mg/1;对照 MS,各80瓶,在无菌条件下,分别取草莓组培丛芽接种于上述培养基中70天后进行 NR 活性的测定:取草莓组培植株0.5克,置三角瓶中,各瓶中分别加入5ml 0.1M/L 硝酸缓冲液,5ml 0.2M/L     

Hsp70A-RBCS2融合启动子调控PHB合成酶基因在莱茵衣藻中的表达

利用Hsp70A-RBCS2融合启动子构建了新型的莱茵衣藻表达载体,并获得了聚-β-羟基丁酸（PHB）合成酶基因（phbC）的衣藻表达载体p105C124和pH105C124.通过＂珠磨法＂分别将上述两个衣藻表达载体导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC-849（Chlamydomonas reinhardtii CC-849）中,得到了具有Zeomycin抗性的转基因藻株.Hsp70A-RBCS2启动子介导的外源基因遗传转化效率明显高于RBCS2启动子,Southern杂交结果显示,phbC基因以低拷贝数整合进莱茵衣藻的基因组DNA中.在光照下,Hsp70A-RBCS2融合启动子能够有效调控phbC基因在莱茵衣藻中的转录和翻译,得到的蛋白产物具有PHB合成酶活性,40℃热激诱导可使PHB合成酶的酶活性提高到1.8倍.因此,Hsp70A-RBCS2融合启动子可使phbC基因在莱茵衣藻中实现可诱导的表达,该研究对利用衣藻合成PHB具有重要的学术意义,进一步的研究将通过＂共转化＂法获得二价或三价的转基因藻,最终实现在转基因藻中合成PHB.     

厚叶莲花掌的组织培养和植株再生

植物名称:厚叶莲花掌(Haworthia cymbiformis)。材料类别:花茎,再生植株的叶。培养条件:采用MS培养基,附加BA2mg/ml(单位下同)和NAA0.2,以诱导愈伤组织和芽分化;用1/2MS+NAA0.1,以壮苗和诱导生根。获得较多增殖材料后,可采用液体培养基增殖与生根。培养基中均用30g/L白糖代替蔗糖。培养室温度24—26℃,每天用日光灯辅助照明16小时,光照度1000—1600 1x。     

介绍一种培养衣藻的新方法

最近,我用琼脂培养基培养衣藻效果很好,其配方如下:硝酸钾1克、氯化钾0.25克、硫酸镁0.25克、磷酸氢二钾0.25克、1％的硫酸亚铁0.2毫升、水1000毫升。以上各盐类溶于1000毫升水中,再加10克琼脂,加热溶解后,倒入试管中(占1/4)高压(1.5kg/cm)灭菌40分钟,取出摆成斜面,自然冷却后在无菌条件下,用接种环将衣藻接种在斜     

硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝酸还原酶基因的克隆

硝酸盐在植物体内的积累过多已成为影响蔬菜品质并影响人类健康的重要因素。硝酸还原酶（NR）是硝酸盐代谢中的关键酶,提高其活性有利于硝酸盐的降解。为了解植物不同组织中NR的活性,用活体测定法检测了经50mmol/L的KNO₃诱导不同时间后的油菜、豌豆和番茄幼苗根茎叶中NR活性,同时为了明确外源诱导剂浓度与植物体内NR活性的关系,检测了经不同浓度KNO₃诱导2h后的矮脚黄、抗热605、小白菜和番茄叶片中的NRA。结果表明,不同植物组织NR活性有很大差异,叶中NR活性较高,根其次,茎最低;不同植物的NR活性随诱导时间呈不同的变化趋势,相同植物不同组织的NR活性变化趋势相似;不同植物叶片NRA为最高时KNO₃浓度不同。用30mmol/L的KNO3诱导番茄苗2h后,从番茄根和叶中提取总RNA,用RT-PCR方法获得NR cDNA,全长2736bp,编码911个氨基酸。为进一步利用该基因提高植物对硝酸盐的降解能力打下基础。     

希尔反应

1939年英国生物化学家希尔(Robert Hill)发现从繁缕叶片中提取出的叶绿体,加入叶片的提取液,在光下放出微量氧。用草酸铁代替提取液,可增加放氧量,加入铁氰化钾则可在空气中直接测量氧的释放。离体叶绿体在适当的电子受体存在下,用光来分解水而释放O_2的反应称为希尔反应。所用人工的电子受体     

水稻花药液体培养下影响愈伤组织诱导和分化的一些因素的研究

水稻花药液体漂浮培养能大幅度提高愈伤组织诱导频率,但这些愈伤组织的分化能力很低。为了提高液体培养下愈伤组织的分化频率,试验了5种诱导培养基和4种分化培养基。结果表明,诱导培养基对愈伤组织分化能力的高低起主要作用,其中以过滤灭菌的马铃薯提取液培养基的效果最好,绿苗分化率可高达50％;分化培养基对愈伤组织分化频率的影响较小,且不甚规律。浮在液面上的愈伤组织比沉在培养液底部的愈伤组织有较高的分化能力。愈伤组织转移时间的早晚对分化频率也有很大影响。     

小G蛋白BBS3b的原核表达纯化及其多克隆抗体制备北大核心

[目的]制备莱茵衣藻小G蛋白BBS3b的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻bbs3b基因的c DNA序列分别构建了带有GST和6×His标签的原核表达载体p GEX-2T-BBS3b和p ET-28a(+)-BBS3b并转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,以12%SDS-PAGE鉴定。用纯化的GST-BBS3b融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第4次免疫后血液并分离血清,利用间接ELISA法进行效价测定,并将抗血清依次经过Protein A纯化和硝酸纤维素膜纯化,用Western Blotting检测抗体特异性。[结果]GST-BBS3b和6×His-BBS3b融合蛋白的分子量分别为46、20 k Da。用ELISA的方法测定抗血清效价为512 000,Western Blotting检测结果显示制备的多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻BBS3b蛋白。[结论]制备的多克隆抗体效价为512 000,能够特异性识别莱茵衣藻中BBS3b蛋白,为利用莱茵衣藻作为模式生物进行BBS3b在纤毛信号传导中的作用机理研究奠定了基础。     

NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定

构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性。根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域。设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒。转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证。鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定。克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19–393 aa)、NR1-S1(编码394–544 aa)和NR1-S2(编码663–800 aa)。其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段。经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒p Cold-SUMO-M1和p Cold-SUMO-S1-GT-S2。SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S1-GT-S2蛋白。对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白。Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应。本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S1-GT-S2纯化蛋白。该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测。     

硝酸还原酶的研究动态

NR的研究已有30多年的历史。近年来,(1)在NR纯化的基础上对其结构和特性已积累了大量资料;(2)根据用新的生物学技术的研究结果,提出酶的诱导可能是酶的从头合成或者酶前体的活化;(3)从NR的合成与降解、活化与钝化等方面,对体内NR活力的调节作了进一步阐述;(4)利用植物NR突变体,开展了NR基因的结构和表达的研究,并取得—定进展。     

CPI大部分缺失影响莱茵衣藻光能转换特性的研究

用紫外光处理野生型莱菌衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC－125得到突变体CC－1047。电泳检测证明：突变型衣藻CC－1047缺失了绝大部分色素蛋白复合体I（CPI）。进而详细地研究了CPI的部分缺失对突变型衣藻的光物理和光化学反应的影响。野生型衣藻的低温荧光峰有两个,分别在691nm和717nm左右;突变型CC－1047的低温荧光峰只有一个,在709nm左右,且荧光强度增加了3－4倍。709nm的峰被认为是光系统I捕光天线色素所发出的。在突变体中出现的这个峰,说明天线色素吸收的光能未能传递到光系统I的反应中心,再进行电荷分离;而是以荧光的形式也发生了改变,野生型和突变型的荧光在开启作用光后都很快上升,但随后野生型的逐渐下降,而突变型CC－1047的基本上不下降;与野生型相比,突变型衣藻CC－1047的光系统I反应中心色系P700的氧化还原活性降低80％以上,表明突变型衣藻细胞内与PSI相关的电子传递已不能正常运转。