| NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定 |
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| 引用本文： | 包玎,李伟,石乐明,李全贞.NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定[J].生物工程学报,2017,33(12):1979-1988. |
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| 作者姓名： | 包玎 李伟 石乐明 李全贞 |
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| 作者单位： | 1 温州医科大学 检验医学院与生命科学学院，浙江 温州 325035,1 温州医科大学 检验医学院与生命科学学院，浙江 温州 325035,2 复旦大学 生命科学学院，上海 200433,1 温州医科大学 检验医学院与生命科学学院，浙江 温州 325035 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金 (Nos. 81671621, 81270852) 资助。 |
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| 摘 要： | 构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性。根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域。设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒。转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证。鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定。克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19–393 aa)、NR1-S1(编码394–544 aa)和NR1-S2(编码663–800 aa)。其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段。经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒p Cold-SUMO-M1和p Cold-SUMO-S1-GT-S2。SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S1-GT-S2蛋白。对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白。Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应。本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S1-GT-S2纯化蛋白。该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测。
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| 关 键 词： | NMDAR1，膜外蛋白，原核表达，纯化 |
| 收稿时间： | 2017/10/26 0:00:00 |
Expression, purification and immunoreactivity characterization of extracellular antigenic domains of NMDAR1 protein |
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| Ding Bao,Wei Li,Leming Shi and Quanzhen Li.Expression, purification and immunoreactivity characterization of extracellular antigenic domains of NMDAR1 protein[J].Chinese Journal of Biotechnology,2017,33(12):1979-1988. |
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| Authors: | Ding Bao Wei Li Leming Shi and Quanzhen Li |
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| Institution: | 1 School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, Zhejiang, China,1 School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, Zhejiang, China,2 School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China and 1 School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, Zhejiang, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | NMDAR1 extracellular protein prokaryotic expression purification |
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