长春花生物碱合成途径相关基因表达丰度与MeJA处理后基因表达差异分析

长春花(Catharanthus roseus)中含有丰富的次生代谢产物,可产生130多种萜类吲哚生物碱,包括目前临床应用最广的天然植物抗癌药物长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)。长春花萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,TIAs)合成途径包括在内韧皮部相关薄壁细胞、上皮细胞、异细胞和乳管细胞等多种组织细胞内进行的20多步酶促反应。本研究选取TIAs途径上的CPR、LAMT、SLS、STR、SGD、TDC、16-OMT、T16H、D4H等9个酶基因,基于长春花转录组数据库,分析其在各组织器官和MeJA处理下的无菌苗、毛状根和悬浮细胞中的数字表达谱,找出其中可能对MeJA信号响应的基因。本研究发现,MeJA处理后,长春花无菌苗中以上9个基因表达量均发生上调;毛状根中除了TDC,另外8个基因表达丰度均为上调;悬浮细胞中除了D4H,另外8个基因表达丰度均上调。对整个转录组数据进行分析,发现经过MeJA处理后,仅有673条Unigene能在无菌苗、毛状根和悬浮细胞中均表现出差异表达,说明无菌苗、毛状根和悬浮细胞的MeJA应答机制存在较大不同。对这些能在3种体系中均发生差异表达的基因进行功能分类,主要包括初生代谢相关蛋白、次生代谢相关蛋白、植物激素相关蛋白、矿质离子结合蛋白、转运蛋白、信号转导相关蛋白、细胞壁合成与降解相关蛋白、转录因子、植物逆境响应蛋白9个方面。本研究可为通过外源因子调控长春花生物碱的生物合成提供参考。     

应用HPLC图谱进行石蒜属种间关系与分类研究

利用高效液相色谱(HPLC)对石蒜属及其近缘植物中国水仙共17份样品的生物碱进行检测,以各样品生物碱色谱峰的相对保留时间为变量,采用SPSS12.0中的Q型聚类法,得到树形图。聚类分析结果显示,17份样品聚成3类:第Ⅰ类包括长筒石蒜、安徽石蒜、鹿葱、换锦花、中国石蒜、香石蒜、乳白石蒜、红蓝石蒜8个种;第Ⅱ类由石蒜、稻草石蒜、江苏石蒜、忽地笑、玫瑰石蒜、矮小石蒜组成;中国水仙单独成第Ⅲ类。聚类结果与传统分类结果有较好的一致性,并支持鹿葱、玫瑰石蒜、安徽石蒜杂交起源的观点。外形相似的忽地笑与中国石蒜,矮小石蒜与石蒜HPLC图谱明显有别,表现出较远化学亲缘关系。表明HPLC化学图谱可用于石蒜属及其近缘植物中国水仙的分类和鉴别研究,并为石蒜属植物指纹图谱研究和质量控制提供重要参考。     

忽地笑胚外植体的培养

忽地笑(Lycoris aurea)是一种多年生的草本花卉,通常用鳞茎繁殖。石蒜科(Amaryllidaceae)花卉的一些种的组织培养已有资料;而忽地笑胚外植体的培养在国内未见报道。本文简要介绍用忽地笑未成熟胚进行离体培养并得到正常植株的过程。     

基于高通量测序的两种典型忽地笑栽培土壤根际真菌群落多样性

【背景】忽地笑为传统中药材,可用于治疗老年性痴呆症、重症肌无力等疾病,具有重要的药用价值。腐殖土(壤土)适宜忽地笑的生长与栽培,黄棕壤(粘性土)对其生长不利。根际微生物可促进或抑制植物生长,直接影响药用植物产量和有效成分含量的变化,因此近年来对药用植物与根际微生物关系的研究得到了高度重视。【目的】通过2种栽培土壤根际真菌的群落结构及多样性研究,旨在探讨根际真菌对忽地笑生长发育的影响。【方法】提取土壤总DNA,采用高通量测序及生物信息统计分析等方法进行研究。【结果】腐殖土和黄棕壤分别获得真菌ITS1序列42 130和30 176条;腐殖土和黄棕壤根际真菌类群分别划分为6门25纲61目123科208属和5门20纲48目85科138属,最优势门类均为子囊菌Ascomycota (相对丰度70%),但主要优势属及多样性指数等存在较大差异,其中腐殖土的主要优势类群有Ascomycota_unclassified、Fusarium、Zopfiella、Chaetomiaceae_unclassified、Ceratobasidium、Mortierella等,而黄棕壤的主要优势类群为Sordariomycetes_unclassified、 Fusarium、 Acremonium、 Rhizoctonia、Nectriaceae_unclassified、Hymenoscyphus等;通过SPSS统计软件分析表明,腐殖土的Ascomycota_unclassified、Zopfiella、Ceratobasidium、Mortierella等优势类群与忽地笑鳞茎中石蒜碱含量之间呈极显著正相关性。【结论】适宜栽培忽地笑的腐殖土根际真菌的遗传多样性比黄棕壤更丰富;腐殖土根际主要优势类群Ascomycota_unclassified、Zopfiella、Ceratobasidium等可能有利于忽地笑生长发育及其石蒜碱等生物碱积累。     

石蒜属植物分支系统学分析

基于37个形态学、解剖学、孢粉学和细胞学性状及解剖学性状之外的28个形态学、孢粉学和细胞学性状,分别对石蒜属进行分支系统学分析,试图建立石蒜属种间的系统发育关系。利用PAUP^*软件分别构建了最大简约树(MP),所得树的拓扑结构是一致的。同时,基于解剖学9个性状,对石蒜、换锦花、忽地笑、江苏石蒜、长筒石蒜、乳白石蒜、夏水仙、红兰石蒜、安徽石蒜、短蕊石蒜、中国石蒜11个种进行系统发育树构建,其结果也是支持上述系统发育树的。系统发育树结构结果表明,石蒜属16种明显聚为两大类:石蒜、玫瑰石蒜、稻草石蒜和江苏石蒜;广西石蒜、红兰石蒜、换锦花、香石蒜、夏水仙、长筒石蒜、安徽石蒜、中国石蒜、忽地笑、乳白石蒜、短蕊石蒜和陕西石蒜。除换锦花、红兰石蒜及江苏石蒜系统发育位置不同之外,大类群的划分与RAPD指纹图谱基本一致。类群一均属于石蒜亚属(Lycoris亚属)。类群二又可以聚为两小类:广西石蒜、红兰石蒜、换锦花、香石蒜、夏水仙归为一类;长筒石蒜、安徽石蒜、中国石蒜、忽地笑、乳白石蒜、短蕊石蒜和陕西石蒜归为一类。前一子类群除广西石蒜外,都属于整齐花亚属(Symman thus亚属)。后一子类群除长筒石蒜与安徽石蒜外,均属于石蒜亚属(Lycoris亚属)。因此,花冠整齐与否是一个重要的分类特征,但作为石蒜属植物亚属的划分依据,没有得到本研究支持。而在本文中,雄蕊与花被片的位置关系可以作为大分类群划分依据,能否依此来对石蒜属植物亚属进行划分,仍需探讨。另外研究表明叶微形态特征在研究种间亲缘关系时,具有一定的作用。而在种间亲缘关系鉴定时,出叶期不应成为重要的依据。同时研究还表明中国石蒜与忽地笑具有非常近的亲缘关系,与形态学研究一致。     

石蒜属植物多糖组成的分析比较研究

对五种石蒜属植物:安徽石蒜、中国石蒜、忽地笑、换锦花、石蒜多糖的结构组成进行了对比分析。结果表明,安徽石蒜多糖与其他四种植物多糖差异较大,而忽地笑多糖和石蒜多糖相似、中国石蒜多糖和换锦花多糖相似。该研究为探讨石蒜属种间亲缘关系提供实验依据。     

加兰他敏在忽地笑营养器官中的定位(简报)

石蒜属植物为具有地下鳞茎的多年生草本植物．有重要的药用价值,全属植物约有20余种。我国有石蒜属植物约15种,集中分布于长江中下游地区,野生资源比较丰富。忽地笑（Lycorisaurea Herb．）是石蒜属植物在我国分布较广泛的一种。加兰他敏（Galanthamine）等生物碱是石蒜属植物中主要的药用成分。[第一段]     

地黄RgMYB10基因的克隆与表达分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育、逆境胁迫和次生代谢产物积累。该研究通过同源比对和功能注释,在地黄(Rehmannia glutinosa)转录组中筛选出MYB的转录本,设计特异性引物对MYB基因的cDNA序列进行PCR扩增,用水杨酸(SA)、Ag⁺、茉莉酸甲酯(MeJA)和腐胺(Put)这4种诱导子处理地黄毛状根,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测候选MYB基因的表达。结果显示:(1)成功克隆到1个地黄MYB基因,命名为RgMYB10;该基因编码247个氨基酸残基,蛋白质相对分子质量28.48 kD,等电点为5.14,属于R2R3-MYB转录因子。(2)qRT-PCR结果显示,RgMYB10在须根中表达量最高,其次为茎,块根中的表达量最低。(3)RgMYB10在MeJA处理后的毛状根中显著上调表达,为特异响应MeJA诱导的基因,推测RgMYB10基因可能是响应MeJA参与地黄毛蕊花糖苷生物合成的关键转录因子。研究表明,地黄MYB10基因可能参与地黄毛蕊花糖苷的生物合成,为进一步研究MYB10基因在地黄毛蕊花糖苷合成中的功能奠定了基础。     

伪石蒜碱、前多花水仙碱盐酸盐对细胞延长及分裂的抑制作用

目前已知石蒜科植物含有约一百五十种生物碱。其中有些生物碱具植物生长调节作用。Yamagu-chi (1953)曾以石蒜碱(Lycorinc)或石蒜裂碱(Lycorenine)处理蚕豆种子,降低其细胞分裂。Ceriotti(1967)从水仙鳞茎分离出一种生物碱Narciclasine,强烈抑制小麦侧根的生长,显示似秋水仙素的作用。Toshihiko(1968)从石蒜鳞茎分离得两个植物生长抑制剂Lycoricidinol和Lycoricidine,抑制燕麦胚     

外源茉莉酮酸甲酯通过调节相关基因表达诱导光温敏雄性不育小麦BS366离体花药开裂

植物育性与花药开裂性状相关.茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonic acid,MeJA)是一种植物激素,广泛参与植物的胁迫应答和生长发育过程.植物体内存在6类基因所编码的酶共同维持茉莉酮酸(JA)代谢途径的畅通,并与植物花药开裂有关.本研究以小麦光温敏不育系BS366为材料,于抽穗期—开花期进行穗部离体48 h的MeJA外源处理.分别于0、1、3、6、12、24和48 h时间点收集花药并进行RNA提取.通过半定量RT-PCR分析发现,在内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)表达基本一致的情况下,BS366的JA代谢途径中参与调控的6种基因均存在不同程度的诱导表达.经MeJA的48 h处理后的离体花药开裂程度明显增大.本研究获得了BS366离体环境下JA代谢途径基因经MeJA诱导后表达水平的概况,并为诱导BS366花药开裂及人工调控育性,达到高效制种及繁种的目的提供了初步的理论依据.     

红花石蒜生物碱成分研究

我们实验室的前期研究发现红花石蒜中的石蒜西啶类生物碱具有较强的抗烟草花叶病毒(TMV)活性,为进一步研究其作用机制,开展了对红花石蒜化学成分的研究。从红花石蒜中共分离的到11个化合物,通过波谱数据结合理化性质鉴定(~1H NMR、~(13)C NMR、2D NMR、HR-ESI-MS)分别鉴定为pancratinine D(1)、小星蒜碱(2)、8-O-去甲基高石蒜碱(3)、6α-O-甲基石蒜伦碱(4)、力克拉敏(5)、水仙花碱(6)、石蒜碱(7)、力克拉敏N-氧化物(8)、去甲基加兰他敏(9)、二氢石蒜碱(10)、文殊兰碱(11)。采用半叶枯斑法,对其中的三个化合物1、3、10进行了抗TMV活性筛选,发现均有一定的抗TMV活性。其中化合物3的抑制率超过阳性对照宁南霉素。     

外源茉莉酸甲酯通过调节相关基因表达诱导光温敏雄性不育小麦BS366离体花药开裂

植物育性与花药开裂性状相关. 茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonic acid, MeJA)是一种植物激素,广泛参与植物的胁迫应答和生长发育过程. 植物体内存在6类基因所编码的酶共同维持茉莉酮酸(JA)代谢途径的畅通,并与植物花药开裂有关. 本研究以小麦光温敏不育系BS366为材料,于抽穗期—开花期进行穗部离体48 h的 MeJA外源处理. 分别于0、1、3、6、12、24和48 h时间点收集花药并进行RNA提取. 通过半定量RT-PCR分析发现,在内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase, GAPDH)表达基本一致的情况下,BS366的JA代谢途径中参与调控的6种基因均存在不同程度的诱导表达. 经MeJA 的48 h处理后的离体花药开裂程度明显增大. 本研究获得了BS366离体环境下JA代谢途径基因经MeJA诱导后表达水平的概况,并为诱导BS366花药开裂及人工调控育性,达到高效制种及繁种的目的提供了初步的理论依据.     

忽地笑二级侧脉凸起突变体相关基因表达差异分析与克隆

忽地笑Raised Secondary Lateral Veins (RSLV)突变体平行脉间横向二级侧脉显著凸起, 生长不良, 雄蕊完全退化。本研究利用表达型噬菌体载体ZAP构建了野生型和突变体忽地笑叶片cDNA文库, 分别随机挑取cDNA克隆进行5′端测序, 共得到3,122条有效ESTs。利用这些ESTs序列, 选择非冗余基因, 设计512条70 mer的特异性序列为寡核苷酸探针, 制作芯片, 对忽地笑野生型和突变体叶器官进行基因表达谱分析。进一步采用实时定量PCR技术验证芯片实验结果, 最终确定所检测的基因中, 有5个基因在突变型和野生型间表达差异显著, 分别是韧皮部蛋白2 (phloem protein 2, PP2)、铁蛋白(ferritin)、果胶甲酯酶(pectin methyl esterases, PMEs), 以及叶绿素a/b结合蛋白和丙酮酸脱羧酶等。克隆获得了其全长cDNA, 并探讨了这些差异基因与忽地笑突变型形成的可能关系。     

镉超积累植物及植物镉积累特性转基因改良研究进展

植物提取修复技术是一项既经济又环保的土壤镉(Cd)污染修复技术,该技术的关键是筛选Cd超积累植物或利用基因工程手段改良植物以提高其Cd积累能力。人们已发现遏兰菜等7种Cd超积累植物及美人蕉等潜在的Cd超积累植物。还发现了许多与Cd耐受和积累能力有关的基因:(1)编码与Cd积累、耐受有关酶的基因,如细菌中的ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid),植物中的PCS(Phytochelatin Synthase)基因;(2)编码金属结合蛋白的基因:MT(Metallothionein)、转运蛋白(P-type ATPase、ABC型转运器)基因;(3)其它相关基因:Hvhsp17、PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related gene number 2)等。并将其中的一些基因转入到其它生物中,提高了其对Cd的耐受性和积累量,为实现Cd污染土壤修复的目标奠定基础。     

香蕉MaSNAT2基因的克隆与表达分析北大核心CSCD

5羟色胺-N-乙酰转移酶(SNAT)是褪黑素合成过程中的关键酶之一。为揭示香蕉SNAT基因的功能,该研究对香蕉SNAT进行了全基因组鉴定,获得其中2个成员(MaSNAT1和MaSNAT2)并对它们进行克隆验证,结果发现仅MaSNAT2表达。对MaSNAT2进行了系列生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR技术研究其在MeJA、ABA、GA_(3)、褪黑素及低温处理下的表达模式。结果显示:(1)MaSNAT2基因CDS长度为741 bp,编码246个氨基酸;MaSNAT2蛋白定位于叶绿体,具有GNAT超家族典型保守Acetyltransf_7结构域;MaSNAT2二级结构主要由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成,三级结构与水稻OsSNAT相似度为81.60%。(2)MaSNAT2蛋白与小果野蕉SNAT相似度最高,亲缘关系最近;MaSNAT2启动子具有MeJA、ABA和GA_(3)等激素响应元件。(3)qRT-PCR结果显示,MaSNAT2基因的表达受ABA抑制;GA_(3)处理8 h和48 h后MaSNAT2表达量分别升高15.1倍和16.2倍;MeJA处理4 h后MaSNAT2表达量提高至5.2倍;褪黑素及低温处理能显著诱导MaSNAT2的表达。研究表明,MaSNAT2属于GNAT超家族,其表达受GA_(3)和MeJA诱导,受ABA抑制;该基因在香蕉响应低温胁迫过程中也发挥重要作用。     

忽地笑LaSUVH1基因克隆与功能分析

为了深入探究忽地笑(Lycoris aurea)组蛋白赖氨酸甲基转移酶(histone lysine methyltransferase, HKMT)基因的功能,该研究根据前期转录组测序结果,采用RT PCR方法克隆得到一个组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因LaSUVH1。序列分结果表明, LaSUVH1基因的编码区(coding sequences, CDs)序列长2 007 bp,编码668个氨基酸残基;LaSUVH1蛋白不具有信号肽结构,无跨膜结构,为亲水性蛋白,含有SET、YDG/SRA、Pre SET和Post SET结构域;序列比对和系统进化树分析发现,LaSUVH1与芦笋AoSUVH1 like蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,LaSUVH1基因在忽地笑不同组织部位均有表达,且在叶中表达量最高。经潮霉素筛选成功获得3个反义过表达LaSUVH1的转基因拟南芥株系。进一步功能分析发现,反义过表达LaSUVH1促进了拟南芥幼苗侧根的发生,降低了拟南芥对NaCl的耐受性,增加了拟南芥种子萌发对脱落酸(ABA)的敏感性,表明LaSUVH1基因响应盐胁迫应答可能依赖ABA信号通路。     

石蒜属种间亲缘关系RAPD分析

采用RAPD标记构建了石蒜属Lycoris植物13个种的指纹图谱。从520个随机引物中筛选出清晰且多态性高的41个引物,共产生了350条DNA片段,分子量在0.3-3.0kh之间,其中253条谱带具有遗传多态性,约占72．3％,平均每个引物扩增的DNA片段数为6．2条。采用TFPGA数据分析软件,计算Nei氏相似性系数和遗传距离,建立了UPGMA聚类图。结果表明：石蒜属13个种明显聚为两大类,即具有单型核型结构（I型）,染色体基数为x=11的5个物种：玫瑰石蒜L.rosea,红蓝石蒜.L.haywardii,稻草石蒜L.straminea,换锦花L.sprengeri和石蒜L.radiata聚为一类;具有两型核型结构（V型和I型）8个物种即江苏石蒜L.houdyshelii,乳白石蒜L.albiflora,中国石蒜L.chinensis,长筒石蒜L.longituba,安徽石蒜Lanhuiensis,夏水仙L.squmigera,短蕊石蒜L.caldwellii和忽地笑L.aurea聚为一类。其中玫瑰石蒜和红蓝石蒜的亲缘关系最近,石蒜和忽地笑的亲缘关系较远,与细胞学的研究结果相吻合。通过RAPD分析,对玫瑰石蒜,红蓝石蒜和稻草石蒜是否天然杂交起源以及乳白石蒜,稻草石蒜和江苏石蒜的分类地位进行了探讨。     

药用植物长春花WRKY转录因子的鉴定及表达谱分析

WRKY是调控植物生长发育和逆境胁迫反应等生命活动的一个转录因子大家族.然而,有关药用植物长春花CrWRKY转录因子的种类和功能却知之甚少.从26 009个长春花蛋白中鉴定出47个CrWRKY转录因子.依据WRKY结构域和系统进化,将CrWRKY分为G1、G2和G3三大类群.表达谱数据分析表明,长春花CrWRKY基因的表达具有器官特异性.47个CrWRKY基因的表达谱可分为3种表达模式:第1类型主要在花、甲基茉莉酸甲酯(MeJA)或酵母提取物(YE)处理的原生质体中高表达;第2类型主要在茎和毛状根中高表达;第3类型在根、茎、叶、幼苗和MeJA处理的毛状根中高表达.进一步用实时定量PCR检测了16个代表性CrWRKY基因在不同器官、MeJA处理原生质体和毛状根中的表达模式,检测结果与上述数字基因表达谱数据基本一致.约1/3以上CrWRKY基因的表达受MeJA和YE的调控,暗示它们可能参与萜类吲哚生物碱的合成和逆境胁迫反应.为进一步解析长春花WRKY转录因子的功能和萜类吲哚生物碱合成调控的网络奠定了基础.     

忽地笑酌-生育酚甲基转移酶基因LaTMT的克隆与表达分析

采用RACE技术从忽地笑也Lycoris aurea ( L'Hér.) Herb.页叶片中克隆获得γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因,命名为LaTMT。序列分析结果显示：该基因cDNA全长1458 bp,其中开放阅读框( ORF)长1017 bp,编码338个氨基酸残基。 LaTMT基因编码蛋白质的理论相对分子质量37560,理论等电点pI 8.70,为亲水性蛋白,无跨膜结构但具有信号肽结构;并具有S-腺苷甲硫氨酸( SAM)甲基转移酶保守结构域,包含3个SAM结合位点;该蛋白的二级结构中包含44.08%的α-螺旋、32.84%的无规则卷曲、12.72%的延伸链和10.36%的β-转角。序列比对和系统进化树分析结果显示：LaTMT蛋白属于S-腺苷甲硫氨酸-依赖性γ-生育酚甲基转移酶家族,与其他植物γ-TMT蛋白的一致性为64%~75%;在 NJ系统树上, LaTMT蛋白与单子叶植物γ-TMT蛋白聚为同一大类,并与油棕( Elaeis guineensis Jacq.) EgTMT和美洲油棕也Elaeis oleifera ( Kunth) Cortés页EoTMT聚为同一类,亲缘关系最近。基因表达分析结果显示：LaTMT基因可在大肠杆菌中成功表达,且表达量随异丙基硫代半乳糖苷( IPTG)诱导时间的延长而增加;在忽地笑的根、叶片、花苞、子房、雄蕊、花瓣和鳞茎中LaTMT基因均可表达,其中在叶片中的相对表达量最高,在子房、雄蕊和鳞茎中的相对表达量相对较低,具有明显的组织特异性。研究结果表明：忽地笑LaTMT基因在进化过程中具有很高的保守性;该基因主要定位于叶绿体中,并与忽地笑对非生物逆境胁迫的抗性相关。     

茉莉酸甲酯处理雷公藤悬浮细胞的基因差异表达分析

以不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)为诱导子对雷公藤悬浮细胞进行处理,采用cDNA-AFLP技术对差异表达基因进行研究。结果表明,茉莉酸甲酯在50～400μmol/L浓度范围内对雷公藤悬浮细胞总碱的积累呈抑制作用。茉莉酸甲酯处理后,分析筛选出了19个雷公藤悬浮细胞内差异表达的基因。通过与NCBI蛋白质数据库比对,7个片段的功能得以预测,涉及植物细胞的信号转导、转录调控和能量代谢等。这些结果对今后利用生物技术手段提高雷公藤生物碱含量奠定了一定基础。