FtMYB1转录因子调控苦荞毛状根黄酮醇合成的机理研究

R2R3-MYB转录因子在植物类黄酮合成中起重要的调控作用。本研究从川荞1号中克隆获得一个R2R3-MYB家族基因FtMYB1,酵母转录激活分析显示其具有转录激活活性,激素处理下的表达模式分析显示,FtMYB1基因能够被茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导表达。在苦荞毛状根中过表达FtMYB1基因,结果表明转基因毛状根株系中总黄酮和芦丁含量显著低于野生型,且在黄酮醇合成途径下游分别编码黄酮醇合酶(FLS)和鼠李糖基转移酶(RT)的FLS和RT1基因表达量在转基因株系中显著降低,表明FtMYB1可能通过调控FLS和RT1的表达来抑制黄酮醇的生物合成。     

药用植物长春花WRKY转录因子的鉴定及表达谱分析

WRKY是调控植物生长发育和逆境胁迫反应等生命活动的一个转录因子大家族.然而,有关药用植物长春花CrWRKY转录因子的种类和功能却知之甚少.从26 009个长春花蛋白中鉴定出47个CrWRKY转录因子.依据WRKY结构域和系统进化,将CrWRKY分为G1、G2和G3三大类群.表达谱数据分析表明,长春花CrWRKY基因的表达具有器官特异性.47个CrWRKY基因的表达谱可分为3种表达模式:第1类型主要在花、甲基茉莉酸甲酯(MeJA)或酵母提取物(YE)处理的原生质体中高表达;第2类型主要在茎和毛状根中高表达;第3类型在根、茎、叶、幼苗和MeJA处理的毛状根中高表达.进一步用实时定量PCR检测了16个代表性CrWRKY基因在不同器官、MeJA处理原生质体和毛状根中的表达模式,检测结果与上述数字基因表达谱数据基本一致.约1/3以上CrWRKY基因的表达受MeJA和YE的调控,暗示它们可能参与萜类吲哚生物碱的合成和逆境胁迫反应.为进一步解析长春花WRKY转录因子的功能和萜类吲哚生物碱合成调控的网络奠定了基础.     

TrMYB308基因的克隆及在苦荞毛状根中的功能分析

MYB类转录因子广泛参与调控植物的生长发育过程,对植物次生代谢也具有重要调控作用。前期研究以V型紫斑白三叶为材料,通过RNA-Seq技术,筛选出与类黄酮合成相关的转录因子TrMYB308。在此基础上从V型紫斑白三叶中克隆出TrMYB308基因,该基因的ORF全长为921 bp,编码306个氨基酸。亚细胞定位结果表明,TrMYB308定位于细胞核。多序列比对和系统发育分析表明,TrMYB308属于典型的R2R3-MYB转录因子,且该蛋白与红三叶TaMYB308和苜蓿MtMYB308等蛋白亲缘关系较近。表达特性分析结果表明,Tr MYB308基因在紫斑白三叶各个组织中均有表达,且其表达量受JA的诱导。在苦荞毛状根中异源表达TrMYB308,结果发现转基因根系中的类黄酮代谢途径部分关键酶基因(如FtF3H和FtFLS)的表达量明显增加;转基因根系总黄酮的含量明显高于对照组。基于以上结果,推测TrMYB308可能参与类黄酮次生代谢生物合成调控。本研究为荞麦类黄酮合成分子机制探索及荞麦品质改良提供了理论依据。     

小麦R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4D的克隆及功能分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物各种生理生化过程。该研究通过对小麦基因组测序数据库进行同源搜索,利用电子克隆技术从紫色籽粒小麦品种‘高原115’中分离得到了一个新的MYB基因TaMYB3-4 D。结果表明,TaMYB3-4D仅含有一个内含子,其编码蛋白含有2个连续的MYB结构域,为典型的R2R3-MYB蛋白。TaMYB3-4D系统发生关系上与调控花青素合成的MYB基因亲缘关系较近。TaMYB3-4 D与bHLH基因ZmR瞬时表达能够诱导白色胚芽鞘中花青素的合成。此外,TaMYB3-4 D基因仅在‘高原115’含花青素的种皮和胚芽鞘中表达,在根、茎、叶中均未表达。研究表明,TaMYB3-4 D基因是一个具有调控花青素合成代谢功能的R2R3-MYB基因,很有可能参与小麦花青素的生物合成。     

COI1参与茉莉酸调控拟南芥吲哚族芥子油苷生物合成过程

芥子油苷是一类具有防御作用的植物次生代谢产物,外源激素茉莉酸对吲哚族芥子油苷的合成具有强烈的诱导作用,但茉莉酸调控吲哚族芥子油苷生物合成的分子机制并不清楚。以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型和coi1-22、coi1-23两种突变体为研究材料,通过茉莉酸甲酯(MeJA)处理,比较了拟南芥野生型和coi1突变体植株吲哚族芥子油苷含量、吲哚族芥子油苷合成前体色氨酸的生物合成基因(ASA1、TSA1和TSB1)、吲哚族芥子油苷生物合成基因(CYP79B2、CYP79B3和CYP83B1)及调控基因(MYB34和MYB51)的表达对MeJA的响应差异,由此确定茉莉酸信号通过COI1蛋白调控吲哚族芥子油苷生物合成,即茉莉酸信号通过信号开关COI1蛋白作用于转录因子MYB34和MYB51,进而调控吲哚族芥子油苷合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1和前体色氨酸的合成基因ASA1、TSA1、TSB1。并且推断,COI1功能缺失后,茉莉酸信号可能通过其他未知调控因子或调控途径激活MYB34转录因子从而调控下游基因表达。     

长春花生物碱合成途径相关基因表达丰度与MeJA处理后基因表达差异分析

长春花(Catharanthus roseus)中含有丰富的次生代谢产物,可产生130多种萜类吲哚生物碱,包括目前临床应用最广的天然植物抗癌药物长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)。长春花萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,TIAs)合成途径包括在内韧皮部相关薄壁细胞、上皮细胞、异细胞和乳管细胞等多种组织细胞内进行的20多步酶促反应。本研究选取TIAs途径上的CPR、LAMT、SLS、STR、SGD、TDC、16-OMT、T16H、D4H等9个酶基因,基于长春花转录组数据库,分析其在各组织器官和MeJA处理下的无菌苗、毛状根和悬浮细胞中的数字表达谱,找出其中可能对MeJA信号响应的基因。本研究发现,MeJA处理后,长春花无菌苗中以上9个基因表达量均发生上调;毛状根中除了TDC,另外8个基因表达丰度均为上调;悬浮细胞中除了D4H,另外8个基因表达丰度均上调。对整个转录组数据进行分析,发现经过MeJA处理后,仅有673条Unigene能在无菌苗、毛状根和悬浮细胞中均表现出差异表达,说明无菌苗、毛状根和悬浮细胞的MeJA应答机制存在较大不同。对这些能在3种体系中均发生差异表达的基因进行功能分类,主要包括初生代谢相关蛋白、次生代谢相关蛋白、植物激素相关蛋白、矿质离子结合蛋白、转运蛋白、信号转导相关蛋白、细胞壁合成与降解相关蛋白、转录因子、植物逆境响应蛋白9个方面。本研究可为通过外源因子调控长春花生物碱的生物合成提供参考。     

虎杖转录因子PcMYB2的表达特性和功能分析

对虎杖R2R3-MYB转录因子PcMYB2进行转录活性鉴定和表达特性分析,并在转基因拟南芥和转基因毛状根中进行功能研究。利用酵母单杂交试验分析PcMYB2的转录活性;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测虎杖中PcMYB2的表达模式;DMACA法检测PcMYB2转基因拟南芥和虎杖毛状根中的原花青素含量。酵母单杂试验表明,PcMYB2具有转录激活活性;RTqPCR结果显示,PcMYB2在虎杖根、茎、叶中均有表达,在叶中表达量最高,并且ABA和H₂O₂外源处理可诱导叶片中PcMYB2的表达;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥种皮颜色加深,原花青素含量为野生型的1.8倍;与野生型毛状根相比,转基因毛状根DMACA染色更深,原花青素含量为野生型的2.3倍。PcMYB2具有转录激活活性,且促进植物原花青素的生物合成。     

秋葵AeMYB1R1转录因子基因克隆及对胁迫的响应北大核心CSCD

MYB转录因子家族广泛参与了植物对干旱、盐渍、冷害等非生物胁迫的应答。为了深入研究秋葵[Abelmoschus esculentus(L.) Moench]中的MYB类转录因子,该研究以‘北海道1号’秋葵为研究对象,采用PCR方法克隆AeMYB1R1基因,并借助生物信息学进行特征分析;采用qRT-PCR荧光定量方法分析其表达模式及其在非生物胁迫下的表达特性。结果表明:(1)成功克隆获得1个秋葵AeMYB1R1基因;该基因包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸;序列对比和系统进化树结果显示,AeMYB1R1在植物进化过程中具有较高的保守性;AeMYB1R1蛋白分子量为37 891.57 Da,等电点为8.75,含有较多的谷氨酸和较少的色氨酸,以及较多潜在的磷酸化位点和糖基化位点。(2)结构分析显示,AeMYB1R1蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲构成,无信号肽和跨膜结构,为疏水性蛋白;同时,氨基酸序列在第104至第156位含有一个保守结构域,表明其属于SHAQKYF类MYB家族转录因子。(3)qRT-PCR结果显示,AeMYB1R1基因在秋葵叶中的表达量最高,其次是根和茎,具有组织表达特性;与高温和低温胁迫相比,在盐胁迫和干旱胁迫中AeMYB1R1表达量更高,说明AeMYB1R1可能是秋葵抗盐和抗旱的关键转录因子。研究结果为AeMYB1R1基因在秋葵生长发育和抗逆机制中的功能研究奠定了理论依据。     

陆地棉MYB类转录因子基因GhTT2克隆及功能初步分析

原花青素作为植物重要的次生代谢产物,是植物应对生物和非生物胁迫的一种重要防御手段,也是影响植物发育和品质的重要因素。原花青素作为花青素生物合成的一条末端通路在模式植物中已有研究,但是具体代谢和调控机制尚不明确;原花青素作为棕色棉纤维呈色的主要物质,其棉纤维呈色的生化与分子机制仍未完全阐明。本研究从陆地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了一个MYB类转录因子基因GhTT2 (transparent testa 2),并对其基因结构、表达模式、亚细胞定位及功能进行了分析。结果表明：GhTT2转录因子具有典型的MYB结构域,在纤维中优势表达,其转录水平随花青素含量增加而降低;该基因可被原核诱导表达;与GFP融合的重组蛋白定位在细胞核;酵母转化结果表明GhTT2具有转录激活功能;在棉花中沉默GhTT2基因的表达,导致原花青素含量显著降低,表明其可能参与调控陆地棉原花青素的生物合成。本研究结果为深入阐明MYB类转录因子参与调控植物原花青素生物合成途径的分子机制提供参考。     

雷公藤AP2/ERF转录因子基因的克隆与分析

该研究以雷公藤发状根为材料,根据雷公藤根转录组数据设计引物,采用RT-PCR方法克隆得到2个雷公藤AP2/ERF转录因子,分别命名为TwAP2/ERF1基因(GenBank登录号:GAVZ01042389.1)和TwAP2/ERF2基因(GenBank登录号:GAVZ01016765.1)。TwAP2/ERF1基因含有一个525bp开放阅读框(ORF),编码186个氨基酸;TwAP2/ERF2基因的ORF为789bp,编码262个氨基酸;2个基因编码的蛋白质均为亲水性蛋白质。系统进化分析表明,TwAP2/ERF1与油桐(Vernicia fordii)AP2/ERF(APQ47444.1)和木油桐(Vernicia montana)AP2/ERF(APQ47365.1)相似性较高,TwAP2/ERF2与毛果杨(Populus trichocarpa)AP2/ERF(XP_002304640.1)和樱桃(Prunus pseudocerasus)AP2/ERF(ALD84477.1)相似性较高。雷公藤发状根经MeJA诱导后,TwAP2/ERF1基因的相对表达量明显提高,并于处理后9h达到最高值,为对照表达量的16.77倍;而MeJA处理对TwAP2/ERF2基因的表达表现出抑制作用,但于处理后48h相对表达量有所提高。研究表明,雷公藤TwAP2/ERF1转录因子响应MeJA早期诱导正调控,推测其可能参与调控雷公藤植物次生代谢产物的生物合成,该研究结果为阐明雷公藤次生代谢物质的生物合成调控与利用现代生物技术提高雷公藤植物细胞中次生代谢物质的含量奠定了基础。     

甜荞花青素合成相关基因FeR2R3-MYB的克隆与表达分析

MYB 是一类常见的转录因子,广泛参与植物花青素生物合成的调控。为探究 MYB转录因子在甜荞花青素生物合成中的调控作用,该研究从红花甜荞和白花甜荞转录组学数据中筛选并克隆出一个和花青素生物合成相关的MYB基因,将其命名为 FeR2R3-MYB,GenBank 登录号为 MT151381.1,并对该序列进行生物信息学分析,以及利用 qRT-PCR 分析FeR2R3-MYB基因在白花甜荞和红花甜荞中的表达特征。结果表明:(1)FeR2R3-MYB基因全长 831 bp,编码 276 个氨基酸,蛋白的相对分子质量为 30.95 kD,理论等电点(pI)为 8.73,蛋白的不稳定指数为 69.64,属于不稳定蛋白,总疏水值为-0.679,整条肽链呈现亲水特性。(2)FeR2R3-MYB 具有典型的 R2R3-MYB 结构域,属于 R2R3-MYB 亚家族。(3)FeR2R3-MYB 与同属蓼科的苦荞和虎杖亲缘关系比较近。(4)FeR2R3-MYB 的启动子序列共含有 9 个光照响应元件、17 个转录因子结合位点、4 个非生物响应元件和 2 个激素响应元件。(5)亚细胞定位发现 FeR2R3-MYB 只在细胞核中表达。(6)FeR2R3-MYB 基因的表达量在叶片和花序中红花甜荞均高于白花甜荞,推测 FeR2R3-MYB 基因可以正向调节甜荞花青素生物合成。综上所述,该研究结果为进一步深化 FeR2R3-MYB 基因在甜荞花青素生物合成途径中的功能及表达调控方面的研究提供了基础。     

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

以地黄为材料,通过分析地黄转录组数据,设计特异性引物,克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS）基因的cDNA序列,命名为RgGGPPS1,GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上,进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示：（1）RgGGPPS1基因开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。（2）生物信息学分析结果显示,RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD),与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。（3）利用构建的原核表达载体pET 32a RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白,采用Ni²⁺亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。（4）荧光定量PCR结果显示,RgGGPPS1基因在根中表达量最高,叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

雷公藤鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析

以雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)发状根为试验材料,采用RT-PCR方法,克隆得到2个雷公藤鲨烯环氧酶编码基因,命名为TwSE1(GenBank登录号MG717395)和TwSE2(GenBank登录号MG717396)。序列分析表明,TwSE1和TwSE2的开放阅读框分别为1 578和1 584bp,分别编码525和527个氨基酸,2条序列相似性为76.18%,但N端序列不保守。实时荧光定量PCR检测雷公藤鲨烯环氧酶在不同组织部位的表达模式,以及雷公藤发状根受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后基因表达的结果表明,TwSE1、TwSE2基因在雷公藤根、茎、嫩叶、老叶、花中均有表达,TwSE1在花中表达丰度最高,在根中表达丰度最低;但TwSE2在花和嫩叶中表达量最高,在老叶中表达量最低,且TwSE2在各组织部位的表达量都低于TwSE1。雷公藤发状根经MeJA诱导后,TwSE1、TwSE2基因表达量均上升,都表现为表达量先上升后下降再上升的趋势,并于诱导后3h达到一个高水平表达,之后下降,在诱导12h后表达量又迅速上升;在相同诱导条件下,TwSE2基因表达水平的提高小于TwSE1基因。     

漆树TvMYB1基因的鉴定及干旱响应潜力分析

该研究筛选漆树MYB转录因子家族成员,经同源比对、开放读码框(ORF)、序列基本特征等分析,选取其中的TvMYB1进行基本生物学信息及逆境表达分析。以一年生漆树(Toxicodendron vernicifluum)盆栽苗为材料,采用RT-PCR技术克隆漆树TvMYB1基因的cDNA,以漆树茎和根部的cDNA为模板对漆树TvMYB1基因进行克隆,采用实时荧光定量(qRT-PCR)分析经PEG6000胁迫后其在根部、茎、叶片中随处理时间的表达变化。结果表明:(1)生物信息学分析显示,TvMYB1基因ORF长900 bp,编码蛋白含299个氨基酸,分子质量为32.45 kD,理论等电点为9.51,其蛋白结构含有1个MYB不完全重复子结构域,属于1R-MYB类,亚细胞定位在细胞核内。(2)进化树分析显示,TvMYB1基因编码蛋白与阿月浑子(Pistacia vera)、可可豆(Theobroma cacao)、柑橘(Citrus sinensis)的MYB蛋白具有较近的亲缘关系。(3)qRT-PCR分析结果显示,经PEG6000处理后,TvMYB1在漆树不同组织中均可被诱导表达,在叶片中的表达量最高,而在根和茎中表达量相对较低。随处理时间延长,TvMYB1在根部和茎中的表达有递增的趋势,在叶片中则相反。研究认为,TvMYB1受渗透胁迫诱导,在漆树干旱响应中具有一定作用,是漆树逆境适应机制研究的重要候选基因。