SARS—CoVSars7a和EGFP融合蛋白真核表达载体构建及其表达

根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于．EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体。采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a—EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白。此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响。     

原核表达载体pET28a-EGFP的构建与表达

以质粒PEGFP-N3中增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）基因片段为模板,利用PCR技术扩增得到EGFP基因片段,并设计引物在其2端引入酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ,对引入酶切位点的EGFP片段和pET28a质粒进行双酶切处理后,利用T4连接酶连接得到了重组质粒pET28a-EGFP。利用热击法把得到的重组质粒pET28a-EGFP转化至E.coliBL21（Escherichia coliBL21）感受态细胞中,当大肠埃希菌LB（Luria-Bertani）培养液在600 nm下的光密度值OD600=0.4时,通过添加异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂诱导EGFP表达。结果表明：重组质粒酶切鉴定及测序结果正确。在自然光下,转化子在LB固体培养基（含1 mmol/L的IPTG和50μg/mL的卡那霉素（Kan））中菌落呈绿色。在荧光显微镜下受蓝光激发,可以清楚观察到发绿色荧光的转化子。成功构建的原核表达载体pET28a-EGFP在E.coliBL21中得到了高效表达,为以后作为荧光标记物标记食源性病原菌提供了一定的理论和技术支持。     

构建稳定表达RFP及嘌呤霉素抗性的K562细胞株

目的构建稳定表达红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）和嘌呤霉素（puromycin）抗性的K562．PM．RFP细胞株,便于慢性粒细胞性白血病研究中K562细胞的观察和筛选。方法采用PCR法获得RFP片段,将其插入到慢病毒pGC-FU-3FLAG-IRES—Puromycin载体中获得pGC—PM—RFP重组质粒,经脂质体转染到293T细胞中获得慢病毒LV—PM—RFP,有限稀释法检测慢病毒在293T细胞中的转染效率,用包装获得的慢病毒感染K562细胞,经嘌呤霉素筛选获得RFP阳性的K562-PM—RFP细胞株。结果PCR及测序结果证实目的基因RFP正确克隆至慢病毒质粒中,经慢病毒LV—PM-RFP感染的K562细胞能在嘌呤霉素抗性培养基中存活,并稳定表达RFP。结论成功构建了慢病毒重组质粒pGC—PM-RFP,并获得了携带RFP及嘌呤霉素抗性基因的K562-PM—RFP细胞株。     

抗菌肽CM4与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）与抗菌肽CM4融合基因的真核表达载体。方法：采用递归PCR（rPCR）将GFP基因与CM4基因通过一段核苷酸片段连接成GFP-CM4融合基因,构建真核表达载体pcDNA3-GFP-CM4,用脂质体介导转染人K562白血病细胞,用MTT检测其活性。结果：融合基因可在K562细胞中表达,抗菌肽CM4的表达可抑制K562细胞的生长。结论：为全面了解抗菌肽的生物学活性及其在基因治疗中的可能作用提供了重要的理论依据。     

人星状病毒非结构蛋白基因nsP1a/1真核表达载体构建及其

目的 将人星状病毒非结构蛋白nsP1 a./1基因连接到真核表达载体上,转染人胚肾上皮细胞48 h后检测其表达.方法 设计特异性引物PCR扩增人星状病毒非结构蛋白nsP1 a/1片段,分别插入真核表达载体pcDNA3.1(+)和pEGFP-N2载体,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-nsP1a/1-His和pEGFP-N2-nsP1a/1.在转染试剂PEI的介导下将重组表达质粒分别转染293T细胞,转染48 h后分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达以及通过Western blot检测nsP1a/1基因的表达.结果 重组表达质粒pcDNA3.1(+)-nsP1a/1-His和pEGFP-N2-nsP1a/1构建成功;转染pEGFP-N2-nsP1a/1后48 h能够在荧光显微镜蓝色激发光下观察到较强的黄绿色荧光;转染pcDNA3.1(+)-nsP1a/1-His后48 h收集细胞进行Western blot检测,能够检测到nsP1a/1-His融合报告基因的表达.结论 成功构建了人星状病毒非结构蛋白nsP1a/1基因真核表达质粒,并在人胚肾上皮细胞293T细胞获得表达,为进一步深入研究nsP1a/1在人星状病毒抵御宿主细胞抗病毒天然免疫中是否发挥作用奠定了基础.     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究

构建真核表达载体pCAG-IRES-SHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达。将SHIP逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）产物克隆入pCAG-IRES-GFP,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pCAG-IRES-SHIP-GFP重组真核表达载体;采用脂质体转染法将pCAG-IRES-SHIP-GFP及空载体转入K562细胞,实时荧光定量PCR（FQ-PCR）、Western blot方法检测转染前后K562细胞中SHIP mRNA和蛋白的表达及Akt磷酸化水平改变,MTT、流式细胞仪检测等方法观察野生型SHIP基因表达对白血病细胞K562凋亡的影响。结果显示重组后的pCAG-IRES-SHIP-GFP质粒已成功载入SHIP的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pCAG-IRES-SHIP-GFP的K562细胞中存在荧光分布。外源性SHIP基因表达能使K562细胞增殖受抑;Western blot检测提示K562细胞Akt308和Akt473的磷酸化水平为较转染前显著下调,分别为转染前的38.7%和36.8％（P＜0.01）。上述结果表明基因全长3.5kb的人野生型SHIP基因真核表达载体质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP构建成功,并在K562细胞中表达;外源性SHIP基因表达能使K562细胞凋亡增加;这些改变可能与p-Akt表达下调有关。     

人RhoB基因真核表达载体的构建和表达分析

旨在构建带Flag标签的人RhoB基因真核表达载体并检测其表达。提取人胚肾细胞HEK-293T总RNA并反转录获得cDNA;设计引物并利用PCR技术扩增RhoB基因的ORF序列;将所扩增序列插入到带Flag标签的pCMV5真核表达载体,插入位点位于限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间,得到真核表达载体Flag-RhoB。酶切并测序验证该质粒的准确性。将成功构建的Flag-RhoB质粒转染乳腺癌MCF7细胞、宫颈癌HeLa细胞以及结直肠癌HCT116细胞,Western Blotting检测RhoB蛋白的表达情况;转染Mv.1.Lu细胞,免疫荧光技术检测该蛋白在细胞中的定位情况。成功扩增出RhoB基因的ORF序列;连入pCMV5中获得真核表达质粒Flag-RhoB;酶切鉴定得到590 bp大小的片段,测序结果显示连入的是RhoB基因的cDNA序列与GenBank相符。Western Blotting结果显示,该质粒可在MCF7细胞、HeLa细胞及HCT116细胞中正确表达。免疫荧光实验显示过表达的RhoB蛋白主要定位于细胞膜上,细胞质中也有分布。成功构建了带Flag标签的人RhoB基因的真核表达载体,该质粒可在细胞中顺利表达。     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7（SEPT7,hCDC10／SEPT7）的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT—PCR方法扩增SEPT7eDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEVT7 eDNA的重组载体pCDNA3／SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT—PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10／SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEVT7 eDNA的重组载体pCDNA3／SEFT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0／G1。期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。     

蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A的表达及性质的研究

克隆了Aspergillus niger T21中的蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A（PRPA）基因,并将它插入pET23b表达载体。在E. coli中表达时,PRPA占菌体总蛋白的34%。经过超声破细胞、硫酸铵分级沉淀和离子交换层析获得了纯度大于90%的重组蛋白。PRPA有二硫键异构酶活性。在PRPA存在下,变性和还原的溶菌酶复性率和复性速度降低,电泳结果表明溶菌酶聚集增多。荧光结果表明PRPA表面有较多的疏水基团。     

膜蛋白的表达：在无细胞体系中实现功能性表达、折叠和组装

膜蛋白在人类和其他物种的生命活动中都起着至关重要的作用.在已完成测序的基因组中,膜蛋白占据30%.药物作用靶向位点、细胞之间的信号传递以及对外界环境的探测等功能,大多是通过生物膜上的特殊膜受体蛋白实现的.膜蛋白研究在工业、环境、国防、医学等领域具有重大意义.嗅觉受体蛋白是一类典型的膜蛋白,属于G蛋白偶联受体家族.嗅觉受体蛋白调控着生物的食物寻找、危险趋避和求偶行为.其主要分布于脊椎动物鼻腔和昆虫触角.嗅觉受体蛋白可以直接识别气味分子,将生物信号转化为电信号,最终传递至神经中枢,进而做出相关应答.膜蛋白的获取并不容易.天然组织中的膜蛋白含量太低不足以支撑学术研究.异源表达难以实现膜蛋白整合上膜,这给膜蛋白的结构和功能研究带来很大挑战.无细胞蛋白质合成系统是一个开放体系,且不依赖细胞活性,是体外表达蛋白质的有效方法.通过无细胞蛋白合成体系,在体外实现膜蛋白二聚体的自组装,将为膜蛋白研究带来全新突破.本文总结了用于无细胞表达的膜蛋白研究进展.     

外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunode- ficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的世界广泛流行、严重危害人类健康的疾病.     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

GnRH及其转运肽基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建GnRH/TRS与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因并表达.方法 利用DNA重组技术,将GnRH/TRS片段克隆至真核表达载体pEGFP-C1转化DH5 α,重组体质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS用LipoGen脂质体进行转染至Hela细胞,核酸序列测定和Western印迹分析基因表达,激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局.结果 重组子pEGFP-C1-GnRH/TR成功构建.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,GnRH/TKS-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.结论 GnRH/TRS-GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性,且不影响GnRH/TRS分子在细胞内的正确表达.     

酿酒酵母表达系统

酿酒酵母是单细胞真核微生物,人们以酿酒酵母为宿主菌,用载体表达外源基因的过程中,积累了丰富的经验,掌握了酿酒酵母表达的许多优缺点,如它繁殖速度快,可以大规模发酵生产,但在发酵过程中会产生乙醇,而乙醇在培养基中积累会影响酵母的生长代谢和基因产物的表达,尤其是进行高密度发酵时该效应更明显;针对这些缺点,可以采取积极的应对措施.主要就酿酒酵母表达系统的组成、优缺点及高效表达的策略等作一综述.     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

To construct the eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 gene and observe its expression in vitro, the recombinant expression vector pVAX1GP120 was constructed by inserting the gp120 gene into the eukaryotic expression vector pVAX1. The pVAX1GP120 was transfected into Vero cells by lipofectamine and the expressed product was detected by indirect immunofluore- scence.Restriction enzymes digestion analysis and sequencing results revealed that the recombinant expression vector pVAX1GP120 has been constructed successfully. The indirect immunofluorescence result showed green fluorescence on the membrane of transfected cells. The constructed eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 can be expressed in vitro, which lay the foundation for the further study of HIV-1 DNA vaccine.