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1.
根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于.EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体。采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a—EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白。此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响。  相似文献   
2.
SARS-CoV Sars7a和EGFP融合蛋白真核表达载体构建及其表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体.采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a-EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白.此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响.  相似文献   
3.
目的:探讨早、中、晚孕期胎盘因子(PF)体外抗人免疫缺陷病毒-1(HTV-1)的作用及其在HIV-1垂直传播中可能的作用.方法:采用荧光染料Calcien-AM标记的H9/HIV-1 ⅢB分别与早、中、晚孕期不同稀释浓度的PF作用后,与MT2细胞混合培养,荧光显微镜下观察合胞体的形成;用游离的HIV-1 ⅢB感染MT2细胞,并分别与早、中、晚孕期不同稀释浓度的PF作用后,用MTT法检测HW-1感染细胞的存活率,用HIV-1 p24抗原试剂盒检测细胞培养上清中p24抗原含量的变化.结果:各孕期PF并不能抑制MT2和H9/HIV-1 ⅢB细胞的融合,但可以增加HIV-1感染细胞的存活率及减少HIV-1 p24抗原的表达,且效应以早孕期PF最大,中孕期PF其次,晚孕期PF最小,并与剂量呈正相关.结论:PF在体外具有抗HIV-1的作用,并呈现孕期和剂量相关性,可能在阻断HIV-1垂直传播中具有一定作用.  相似文献   
4.
利用荧光抗体标记和流式细胞术检测喘可治对刀豆蛋白A(ConA)诱导的T细胞CD69和CD25表达的影响,研究喘可治是否具有促进CD4 CD25 调节性T细胞升高的作用.结果发现喘可治对ConA诱导的T细胞活化标志分子CD69的表达具有抑制作用,但对CD25的表达具有促进作用.说明喘可治对T细胞活化具有抑制作用,CD25表达的上调并不是由活化引起的,而很可能是CD4 CD25 Tr水平升高的标志.  相似文献   
5.
以地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡;利用PI和AnneXin V/PI流式细胞术分别检测细胞晚期和早期凋亡;利用JC-1和DiOC_6(3)/PI在细胞水平检测凋亡中线粒体膜电势(△ψm)变化:抽提线粒体,利用JC-1直接染色技术检测现存线粒体△ψm情况。实验结果显示,DEX显著诱导胸腺细胞早期和晚期凋亡,凋亡细胞主要来自G_0/G_1期;细胞水平可见DEX介导与△ψm相关的J-aggregate和DiOC_6(3)可染性降低,同时介导线粒体数量显著降低,6h细胞膜完整性无显著变化:单纯线粒体检测结果显示,多数线粒体维持正常△ψm。提示,DEX介导胸腺细胞凋亡中线粒体数量降低,现存线粒体多保持着正常△ψm以维持凋亡过程细胞能量供给。  相似文献   
6.
Jagged1是Notch信号通路中的一个配体,近来许多研究表明,它能诱导树突状细胞的成熟,并通过促使T淋巴细胞分化成调节性T细胞或II型T辅助细胞,从而诱导免疫耐受。  相似文献   
7.
将PCR扩增得到的人角质细胞生长因子(hKGF)基因片断插入穿梭载体pAdTrack-CMV,产生重组质粒pAdTrack-CMV-hKGF,经Pme I线性化后,通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAdEasy-hKGF。采用Lipofectamine 2000将pAdEasy-hKGF转染到HEK-293细胞,在HEK-293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有hKGF基因。获得的重组hKGF腺病毒感染颗粒可高效感染HaCat细胞。Western-blot结果显示,重组腺病毒感染的HaCat细胞可分泌表达hKGF蛋白。  相似文献   
8.
人β2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达   总被引:19,自引:1,他引:18  
β2-微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分,为制备MHCⅠ类分子四聚体的必要成分。根据已报道的序列设计特异引物,利用RT-PCR方法从人白细胞中克隆了β2m基因,并构建了成熟β2m的原核表达载体,在大肠杆菌中得到高效表达。表达的β2m大部分在包涵体中,经洗涤、变性和复性,并以强阴离子交换柱层析纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。此工作为制备MHCⅠ类分子四聚体奠定基础。  相似文献   
9.
加载HCMV抗原肽的HLA-A*0201单体及其四聚体制备和鉴定   总被引:9,自引:4,他引:5  
细胞毒T淋巴细胞(CTL)在控制病原体感染以及抗肿瘤过程中发挥重要作用,因而特异性CTL的检测相当重要;而过去检测CTL的方法都是间接的,最近发展起来的四聚体技术则是直接检测抗原特异性CTL的有效而特异的方法,成为目前研究T细胞免疫应答的关键技术。报道一种简化的四聚体制备程序,利用该程序成功制备加载人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽的HLA-A2四聚体,具有特异性结合CTL活性。HLA-A*0201重链基因是通过RT-PCR方法从HLA-A2+供者白细胞中克隆,进而以PCR方法构建在羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*0201(A2)重链胞外区原核表达载体, A2重组蛋白在大肠杆菌中得到高表达,主要以包涵体形式存在。加载抗原肽的可溶性A2单体是A2胞外区在轻链β2微球蛋白和HLA-A2限制性HCMV pp65495-503抗原肽(NLVPMVATV,NLV)存在时通过稀释法复性获得,以BirA对其进行生物素化,然后以阴离子交换树脂纯化,得到的纯化A2-NLV单体与Streptavidin_PE按4:08比例混合形成四聚体,结合程度在85%以上,流式细胞仪分析显示该四聚体具有与HLA-A2+供者的特异性CTL结合活性。总之,这种简化的四聚体制备程序,不仅有利于该技术的推广,为特异性T细胞免疫研究建立必要的技术平台,而且A2-NLV四聚体在临床监测CMV特异性CTL水平等方面也有应用价值。  相似文献   
10.
Jagged 1与Delta1是Notch信号通路中的两个配体,近来研究表明,它们能影响树突状细胞的分化和成熟,并通过树突状细胞等抗原提呈细胞介导T辅助细胞的不同分化,可能为免疫性疾病的临床治疗提供新的药物靶点.  相似文献   
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