γ-亚麻酸产生菌Mucor sp．EIM-10的筛选及分子鉴定

为了获得高产γ-亚麻酸（γ-linolenic acid,GLA）的菌株,利用苏丹黑染色法筛选获得1株GLA产生菌EIM-10,通过摇瓶培养,其生物量可达11．882g／L,菌丝体油脂含量可达18．86％。气相色谱-质谱（GC—MS）分析表明其γ-亚麻酸质量分数（占总脂肪酸）高达27．68％。为进一步鉴定该菌株,克隆测定了该菌18SrRNA基因序列,并对其进行系统进化树分析,结果表明该菌属于毛霉属,与Mucor racemosus、Mucor plumbeus、Mucor ramosissimus与Mucor circinelloides同属一个分支。     

卷枝毛霉孢子原生质体的制备与再生

为了构建高产γ-亚麻酸的卷枝毛霉稳定遗传转化体系,利用酶解法对卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)EIM-10的孢子进行原生质体制备。研究酶液组成、渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间等对卷枝毛霉孢子原生质体形成和再生的影响,建立了制备卷枝毛霉孢子原生质体的最适条件:1%纤维素酶和2%溶壁酶为酶解体系,0.5mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,酶解温度32℃,酶解时间2.5 h,再生培养基为0.5 mol/L NaCl高渗培养基。用双层平板培养法进行原生质体再生,在此条件下原生质体的形成量为1.2×106个/mL,再生率为70.5%。     

氮胁迫对埃氏小球藻生长及油脂积累的影响

以生长快、可除污的埃氏小球藻株系SXND-25为试材,研究不同氮浓度培养条件对其生物量和油脂产量的影响,以期建立优化培养体系利用该株小球藻生产优质生物燃油。以硝酸钠为氮源、BG11培养基中的氮浓度为基准(1.5 g/L),设置氮浓度梯度对小球藻进行培养。通过光密度测定、尼罗红染色、转酯化法抽提油脂和GC分析,对小球藻生物量、油脂含量及脂肪酸组分进行分析。结果显示,培养8 d时,在氮浓度为1.5 g/L时,生物量达到最大,干重为3.4 g/L,而油脂含量仅为28.24%,油脂产量为0.96 g/L;在氮浓度为0 g/L时生物量最小,干重为0.49 g/L,而油脂含量最高,为44.57%,油脂产量为0.22 g/L;在氮浓度为0.75 g/L时,干重为3.2 g/L,油脂含量为40.36%,油脂产量最高为1.3 g/L,是标准氮浓度下油脂产量的1.4倍。0.75 g/L氮浓度下连续培养8 d,藻油脂肪酸组成更适于制取优质生物柴油。综合生物量、油脂含量及脂肪酸组成等指标,确定0.75 g/L氮浓度为该埃氏小球藻株系规模化培养以生产优质生物燃油的优化参数。     

培养条件对钝顶螺旋藻(Sp)NS-90020脂肪酸组成和含量的影响

研究了不同培养条件对钝顶螺旋藻（Sp）NS－90020脂肪酸合成的影响。随着温度升高,其不饱和脂肪酸,γ一亚麻酸（GLA）相对含量降低,总脂肪酸含量升高,当温度为40℃时总脂肪酸和γ-亚麻酸绝对含量都达到最大值,分别为73．4mg／g干重和11．9mg／g干重;当培养基中NaCl浓度高于0．017mol／L时,其GLA相对含量降低,但低于0．0017mol／L时,对其脂肪酸组成无显著影响;氨水使其脂肪酸和GLA绝对含量升高,并在50mgN（NH3·H2O）时达到最大值,分别为67．96mg／g干重和13．63mg／g千重;暗处理92h使其总脂肪酸和GLA绝对含量升高;缺乏Fe2 或Mg2 或Mo2 时,其总脂肪酸和GLA绝对含量降低,而缺乏PO43-时,其总脂肪酸和GLA绝对含量略有升高。     

雅致枝霉TE7-15发酵生产γ-亚麻酸的实验研究

研究了温度、时间、碳源和氮源对雅致枝霉诱变株TE7- 15的菌体生长、油脂积累及GLA合成的影响 ,确定了TE7- 15菌株适宜的摇瓶发酵培养条件 ,使其菌体生物量达到 19 0 4g/L ,GLA产量达到10 79 95mg/L ,可以满足工业化生产的要求     

雅致枝霉TE7-15发酵生产γ-亚麻酸的实验研究

研究了温度、时间、碳源和氮源对雅致枝霉诱变株TE7-15的菌体生长、油脂积累及GLA合成的影响,确定了TE7-15菌株适宜的摇瓶发酵培养条件,使其菌体生物量达到19.04g/L,GLA产量达到1079.95 mg/L,可以满足工业化生产的要求.     

甘蔗糖蜜发酵生产多不饱和脂肪酸的菌种筛选

利用苏丹黑B染色和测定多不饱和脂肪酸碘值的方法,从土壤中筛选出一株适合用甘蔗糖蜜为原料生产多不饱和脂肪酸的霉菌LB1。研究表明,该菌株培养的最适糖蜜浓度为10°BX,通过单因素实验和正交实验设计,确定了优化培养条件:最适温度28℃、摇床转速为160r/min、pH值为6.0和培养天数为5d。在优化条件下,菌株的油脂含量为其生物量的57.08%,其中油脂中多不饱和脂肪酸的组成及含量为:油酸15.42%,亚油酸14.38%、γ-亚麻酸23.55%、α-亚麻酸3.06%、花生四烯酸9.87%、廿碳五烯酸8.14%、廿二碳六烯酸6.07%等。多不饱和脂肪酸的含量占总脂肪酸的80.49%。对LB1菌株进行形态特征、生理特征分析及5.8S rDNA基因两侧的内转录间隙进行序列分析推测该菌株为反屈毛霉。     

广谱碳源产油酵母菌的筛选

对10株酵母菌利用不同单糖为碳源条件下菌体内积累油脂的能力进行了初步考察,并对菌油进行了分离和脂肪酸组成分析。实验发现,以葡萄糖为唯一碳源时有9株菌油脂含量超过自身细胞干重的20%,可以界定为产油微生物。其中6#菌(T.cutaneumAS2.571)利用葡萄糖发酵菌体油脂含量达到65%(W/W)。所有实验菌株都能同化多种单糖,其中1#菌(L.starkeyiAS2.1390)、4#菌(R.toruloidesAS2.1389)和11#菌(L.starkeyiAS2.1608)表现出对碳源利用的广谱性,能转化五碳糖木糖和阿拉伯糖并在菌体内积累油脂,油脂含量最高达到26%。脂肪酸组成分析结果表明,菌油富含饱和及低度不饱和长链脂肪酸,其中棕榈酸、油酸和亚油酸三者之和占总脂肪酸组成的90%以上,脂肪酸组成分布类似于常见的植物油。这些结果对利用产油微生物转化木质纤维素水解混合糖获取油脂资源的研究具有重要意义。     

毛霉△6-脂肪酸脱氢酶随机突变文库的构建与分析

毛霉Mucor sp.EIM-10△6-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径的关键酶。为提高脂肪酸脱氢酶的活性以及研究该酶一级结构对酶活性的影响,利用易错PCR对毛霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(mcd6)进行随机突变,将PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体PYMD6PMCD6连接,获得随机突变质粒PYTBMCD6,转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了原始库容为4.6×104 CFU的△6-脂肪酸脱氢酶的随机突变表达文库。随机突变表达文库的构建与分析为定点突变等酶蛋白的理性设计奠定基础。     

影响米根霉产γ-亚麻酸的几种因素

利用气相色谱仪对根霉属的部分菌株进行脂肪酸成分分析,发现中华根霉(Rhizopus chinensis)、米根霉(Rhizopus oryzae)和匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)均能产生γ-亚麻酸,其中米根霉R316菌丝体中γ-亚麻酸的含量较高达11.47%,对R316的液体发酵产脂条件进行研究,发现液体摇瓶培养菌丝体的油脂含量可达53.24%,γ-亚麻酸的含量提高到20.12%。R316菌丝体生长的最适碳源为葡萄糖、最适氮源为蛋白胨、最适培养温度20℃。但γ-亚麻酸积累的最适碳源为甘油、最适氮源是尿素、最适温度15℃。同时发现逆境是高产多不饱和脂肪酸的关键。     

少根根霉γ-亚麻酸高产菌株选育及发酵条件优化

经过He-Ne激光复合氯化锂对孢子诱变,以及He-Ne激光处理原生质体的方法,从一株产γ-亚麻酸(GLA)的原始菌株少根根霉(Rhizopus arrhizus)R8中选育出突变株RC378,摇瓶培养菌体油脂含量47.8%,其中GLA占油脂的12.6%,比原始菌株油脂含量提高了130.8%,GLA含量提高了276.7%。突变株油脂组分较原始菌株具明显差异。以麸皮、玉米粉为主要原料固态发酵干基油脂含量保持在9.4%~12.9%, GLA含量在9.8%~12.6%。     

少根根霉γ-亚麻酸高产菌株选育及发酵条件优化*

经过He-Ne激光复合氯化锂对孢子诱变,以及He-Ne激光处理原生质体的方法,从一株产γ-亚麻酸(GLA)的原始菌株少根根霉(Rhizopus arrhizus)R8中选育出突变株RC378,摇瓶培养菌体油脂含量47.8%,其中GLA占油脂的12.6%,比原始菌株油脂含量提高了130.8%,GLA含量提高了276.7%。突变株油脂组分较原始菌株具明显差异。以麸皮、玉米粉为主要原料固态发酵干基油脂含量保持在9.4%~12.9%, GLA含量在9.8%~12.6%。     

碳源、氮源对异养单针藻Monoraphidium sp. FXY-10油脂积累和脂肪酸组成的影响

研究了碳源与氮源对单针藻Monoraphidium sp. FXY-10异养培养的影响。以BG-11为基础培养基,通过添加不同类型、浓度梯度碳源和氮源,比较分析微藻生物量、油脂积累以及脂肪酸组成。结果表明,以葡萄糖作碳源,硝酸钠为氮源,微藻细胞积累的油脂是理想的生物柴油制备原料。硝酸钠浓度分别为1.00、3.00和5.00 g/L时,对油脂产量影响不显著(P>0.05)。葡萄糖浓度为10.00 g/L,硝酸钠为氮源油脂产量达到实验最高值0.84 g/L,其油脂脂肪酸组成主要由C16:0和C18:1等短链饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸组成,不饱和度值(DU)为61.98,相对偏低。     

少根根霉γ—亚麻酸高产菌株选育及发酵条件优化

经过He-Ne激光复合氯化锂对孢子诱变,以及He-Ne激光处理原生质体的方法,从一株产γ-亚麻酸（GLA）的原始菌株少根根霉（Rhizopus arrhizus)R8中选育出突变株RC378,摇瓶培养菌体油脂含量47.8%,其中GLA占油脂的12.6%,比原始菌株油脂含量提高了130.8%,GLA含量提高了276.7%。突变株油脂组分较原始菌株具明显养,以麸皮、玉米粉为主要原料固态发酵干基油脂含量保持在9.4%-12.9%,GLA含量在9.8%-12.6%。     

耐乙酸粘红酵母合成油脂

乙酸是木质纤维素在水解过程中的主要副产物,高浓度的乙酸严重影响产油微生物的生长和油脂合成。本文研究了粘红酵母对乙酸的耐受性及其利用乙酸合成微生物油脂的能力。结果表明,在初始葡萄糖、木糖浓度分别为6 g/L和44 g/L的混合糖培养基中,乙酸浓度低于10 g/L时,不会对菌体生长产生抑制作用,油脂合成还得到了促进。当乙酸添加量为10 g/L时,生物量、油脂产量、油脂含量较对照组分别提高了21.5%、171.2%和121.6%。进一步研究表明,粘红酵母具备利用乙酸合成油脂的能力,当以乙酸为唯一碳源,浓度为25 g/L时,油脂产量达到3.20 g/L,油脂质量得率为13%。微生物油脂成分分析表明,粘红酵母以乙酸为底物制得的油脂可以作为制备生物柴油的油脂原料,其主要成分为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸,其中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量分别为40.9%和59.1%。由于粘红酵母具有利用乙酸合成微生物油脂的能力,在以木质纤维素水解液为原料生产微生物油脂的脱毒过程中,一定浓度的乙酸可以不必脱除。     

变温对破囊壶菌FJN-10脂肪酸组分和蛋白质组的影响

[目的]以破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10为研究对象,研究不同培养温度和变温条件对菌体生物量、油脂含量、脂肪酸组分、关键基因转录以及蛋白质组的影响。[方法]通过摇瓶实验测定干重研究菌株的生长,提取油脂并经液相色谱分析脂肪酸组分;荧光定量PCR和二维电泳研究脂肪酸合成途径关键的碳链延长酶、脱饱和酶的转录水平和蛋白质的差异表达。[结果]28℃培养时,生物量达13.6 g/L,DHA占总脂肪酸含量达32.41%;15℃培养时,生物量为9.8 g/L,DHA占总脂肪酸含量达56.08%。变温培养下生物量最高可达13.9 g/L、油脂含量及DHA含量在较高的水平。28℃降至15℃时,△4脱饱和酶和△6延长酶基因基因的转录分别提高了3.9和2.5倍。[结论]变温条件下菌株生物量在11.8~13.6 g/L,菌体稳定期延长,DHA的含量可达45%以上。可为今后DHA的产业化提供基础数据。     

小球藻与固氮菌Mesorhizobium sp.共培养对小球藻生长和油脂积累的促进效果

微藻油脂不仅可以作为功能油脂,同时也是生产生物柴油的重要原料之一。为解决微藻生长与油脂积累之间的矛盾,利用藻菌共培养技术在缺氮条件下将无菌小球藻与细菌以不同初始比例进行共培养,通过测定藻细胞生物量、油脂含量和脂肪酸比例等来研究藻菌共培养对小球藻生长和油脂积累的影响。结果表明,在小球藻与固氮菌B2. 3 70∶1(V/V)共培养体系中,小球藻的生物量和油脂含量较同样条件下单独培养小球藻有了显著提高。其生物量最高可达1. 68g/L、总脂含量为45. 2%、总脂产率为75. 94 mg/(L·d)、中性脂含量为23. 0%及中性脂产率为38. 65mg/(L·d),其生物量和油脂含量分别较单独小球藻培养时提高了66. 3%和47. 7%。同时细菌的加入显著提高了藻细胞内C18∶1脂肪酸的比例。结论表明,通过藻菌共培养技术能够有效提高微藻生物油脂的质量和产量,具有较好的实际利用价值。     

刺孢小克银汉霉产γ-亚麻酸代谢规律的研究

采用液体发酵的方法,通过研究发酵过程中生物量、油量和GLA合成之间的关系以及MgSO4、MnSO4和(NH)2SO4对三者的影响,明确一株刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)产γ-亚麻酸的代谢规律和不同因子对代谢规律的影响和因子添加的可能性。结果显示,生物量和油量的积累先于GLA到达高峰;在生长中期生物量积累处于稳定,GLA的合成速率高于油脂产生的速率,使得油脂中整体GLA含量开始上升;后期由于营养消耗,菌体利用自身合成的油脂作为能量供给减饱和酶系,GLA含量呈快速增长过程并且持续;Mg^2 、Mn^2 和NH4^ 离子对GLA合成有一定的促进,但作用机制各不相同,可通过在不同的时期的添加使GLA的积累增加。     

拉曼被孢霉F5发酵生产γ-亚麻酸的研究

对拉曼被孢霉突变株F5发酵生产γ-亚麻酸的最适碳源、氮源、发酵时间及温度、无机盐离子添加、最适碳源浓度及补加碳源时间等发酵条件进行了研究探讨.最适发酵培养基组成为(g/L):葡萄糖100,酵母浸出粉4,蛋白胨1,K2HPO4 1,CaCl2 1×10-2,MgSO45×10-2,FeSO4 1×10-2,ZnSO4 7.5×10-3,CuSO4 0.5 × 10-5,MnSO4 2×10-3,pH 6.0.培养温度为25℃,140r/min振荡培养10天,培养8天后(即收获前2天)补加5%葡萄糖.发酵结果为:DC24.59g/L,TL 10.84g/L,TL/DC44.09%,GLA/TL10.67%,GLA产量为1156.63 mg/L. GLA产量较初始结果提高156.15%.该菌株已达到工业化生产菌株要求.     

椒目中高纯度α-亚麻酸的提取分离

椒目作为一种新的木本油脂资源,其油脂中约含有30%的α-亚麻酸,采用本文创制的综合方法可对其中的α-亚麻酸进行有效分离和纯化,为椒目的综合开发和利用奠定了研究基础.椒目经皂化酸解得游离的混合脂肪酸,依次经梯度冷冻、尿素包合及硝酸银络合,得高纯度α-亚麻酸.经HPLC分析,以本文的方法得到的α-亚麻酸含量高达91.6%以上.