真菌发酵生产γ-亚麻酸的研究进展

综述了国内外微生物发酵生产γ-亚麻酸（GLA）的研究进展,对菌株诱变选育研究和基因工程菌株的构建情况进行了阐述,并展望了其发展前景。     

用抗性筛选法选育γ—亚麻酸（GLA）高产菌株

以深黄被孢霉（Mortierella isabellina）为出发菌株,经紫外线诱变处理,采用抗性筛选法,直接在梯度平板上挑选取抗脂肪酸脱氢酶抑制物抑芽丹（maleic hydrazide）的菌株进行初筛,然后经摇瓶发酵法测定相关性能指标进行得筛,获得一株生产性能比出发菌株显提高的突变株M80,其菌体收率达25.10g/L、油脂产率达12.35g/L、γ-亚麻酸（GLA）产率达771.88mg/L。     

培养条件对钝顶螺旋藻(Sp)NS-90020脂肪酸组成和含量的影响

研究了不同培养条件对钝顶螺旋藻（Sp）NS－90020脂肪酸合成的影响。随着温度升高,其不饱和脂肪酸,γ一亚麻酸（GLA）相对含量降低,总脂肪酸含量升高,当温度为40℃时总脂肪酸和γ-亚麻酸绝对含量都达到最大值,分别为73．4mg／g干重和11．9mg／g干重;当培养基中NaCl浓度高于0．017mol／L时,其GLA相对含量降低,但低于0．0017mol／L时,对其脂肪酸组成无显著影响;氨水使其脂肪酸和GLA绝对含量升高,并在50mgN（NH3·H2O）时达到最大值,分别为67．96mg／g干重和13．63mg／g千重;暗处理92h使其总脂肪酸和GLA绝对含量升高;缺乏Fe2 或Mg2 或Mo2 时,其总脂肪酸和GLA绝对含量降低,而缺乏PO43-时,其总脂肪酸和GLA绝对含量略有升高。     

少根根霉γ—亚麻酸高产菌株选育及发酵条件优化

经过He-Ne激光复合氯化锂对孢子诱变,以及He-Ne激光处理原生质体的方法,从一株产γ-亚麻酸（GLA）的原始菌株少根根霉（Rhizopus arrhizus)R8中选育出突变株RC378,摇瓶培养菌体油脂含量47.8%,其中GLA占油脂的12.6%,比原始菌株油脂含量提高了130.8%,GLA含量提高了276.7%。突变株油脂组分较原始菌株具明显养,以麸皮、玉米粉为主要原料固态发酵干基油脂含量保持在9.4%-12.9%,GLA含量在9.8%-12.6%。     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ-亚麻酸（GLA,C183△     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸（GLA）作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3.5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱质谱（GC-MS）联用分析表明高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16.26%。     

大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌

以白色链霉菌Z-18为出发菌株,经大剂量紫外诱变处理,用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸（AEC）氨基酸结构类似物平板定向育种方法,获得1株ε-聚赖氨酸高产菌C-18,其发酵液中ε-聚赖氨酸产量较出发菌株提高42．9％。在含有50g／L葡萄糖的培养基中,ε-聚赖氨酸积累可达1．23g／L。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（GLA,C18：3△^6,9,12）是由△^6-脂肪酸脱氢酶以亚油酸（LA,C18：2△^9,12)为底物,在C6位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△^6-脂肪酸脱氢酶的cDNA,全长为1374个核苷酸,编码457个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,△^6-脂肪酸脱氢酶在其序列的N端特有细胞色素b5(Cytb5)区。这是国际上对深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸(GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。△^6-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3．5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析表明高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16．26％。     

转基因高γ-亚麻酸大豆油抗肿瘤作用的研究

γ-亚麻酸(GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸,在大多数油料作物种子中不含有GLA,而含有其前体物亚油酸。△⁶-脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ-亚麻酸,为了能够在传统的油料作物大豆中产生GLA,将从深黄被孢霉中克隆的△⁶-脂肪酸脱氢酶基因,与植物表达载体pBIl21连接,构建了重组质粒pBIM16,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统,成功地将该基因导入到栽培大豆吉林47品种中,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。通过气相色谱(GC)对大豆种子进行脂肪酸成分分析,结果表明,产生了GLA,其含量最高可达36．585％。将高GLA的转基因大豆油口服给药,结果表明,其对小鼠S180肉瘤、肝癌H22和Ehrlich癌实体型的抑瘤率分别为32．63％、31．91％和34．34％。其肿瘤抑制率均>30％,与对照组比较有显著差异(p<0．01),表现初步的抗肿瘤作用。     

大黄鱼16SrRNA和18SrRNA基因的测定与序列分析

利用多对引物,扩增并测定出大黄鱼16SrRNA基因和18SrRNA基因的部分序列,其长度分别为1202bp和1275bp,16SrRNA基因序列的GC含量为46．12％,18SrRNA基因的Gc含量为53．oo％。将大黄鱼16SrRNA基因序列与GenBank中15种硬骨鱼类的同源序列结合,同时将其18SrRNA基因序列与GenBank中9种脊索动物的同源序列相结合,运用软件获得各自序列间差异百分比,转换和颠换数值等信息。基于这两种基因序列,利用NJ法和BI法,分别构建16种硬骨鱼类和10种脊索动物的分子系统树。18SrRNA构建的系统树包括三大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的1个物种,另一支为2种硬骨鱼类。16SrRNA构建的系统树显示大黄鱼所在的石首鱼科与鲈科和盖刺鱼科亲缘关系较近。此外还讨论了这两个基因的序列特征。     

Fermentation process development of recombinant Hansenula polymorpha for gamma-linolenic acid production

Development in the strain and the fermentation process of Hansenula polymorpha was implemented for the production of gamma-linolenic acid (GLA, C18:3 delta 6,9,12), which is an n-6 polyunsaturated fatty acid (PUFA) and has been reported to possess a number of health benefits. The mutated delta 6-desaturase (S213A) gene of Mucor rouxii was expressed in H. polymorpha under the control of the methanol oxidase (MOX) promoter. Without utilization of methanol a high cell-density culture of the yeast recombinant carrying the delta 6-desaturase gene was achieved by fed-batch fermentation using glycerol-limited conditions. The delta 6-desaturated products, octadecadienoic acid (C18:2 delta6,9), GLA and stearidonic acid (C18:4 delta6,9,12,15), accumulated at high levels under the derepression condition. The GLA production was also optimized by adjusting specific growth rates. The results show that the specific growth rate affected both lipid content and fatty acid composition of the GLA-producing recombinant. Among the various specific growth rates studied, the highest GLA concentration, which was at of 697 mg/l, was obtained in the culture with the specific growth rate of 0.08 /h. Interestingly, the fatty acid profile of the yeast recombinant bearing the Mucor delta 6-desaturase gene was similar to that of blackcurrant oil with both containing similar proportions of n-3 and n-6 essential fatty acids.     

木聚糖酶高产菌株EIM-30的鉴定及其产酶条件的优化

通过对木聚糖酶高产菌株EIM-30基于形态学和18SrDNA序列的系统发育进化分析,鉴定为里氏木霉Trichoder撇reesei。在单因子实验确定EIM-30产木聚糖酶的最适碳源和氮源的基础上,通过Plackett—Burman实验对影响其产酶的相关因素进行评估并筛选出3个显著效应因子,然后应用最陡爬坡实验和响应面分析确定最适产酶培养基配方为：酵母浸膏1．50％,蛋白胨1．00％,NaC10．50％,PPG-20000．10％,MgS041．20％,CaC20．18％,（NH4）2S040．45％,甘油4．18％,乳糖3．05％,K2唧041．59％。优化后TrichodermareeseiEIM-30的液体发酵产木聚糖酶的活力可达9．857×105V／mL,较优化前提高1．98倍。     

实时定量PCR构建法夫酵母内参基因β-actin、 gpd、18S rRNA标准品质粒和标准曲线

为建立检测法夫酵母JMU-MVP14中虾青素合成相关基因在不同生长时期表达水平的实时定量PCR方法,构建法夫酵母JMU-MVP14的管家基因β-actin、gpd、18S rRNA的标准质粒,进行实时定量PCR,制作标准曲线及回归方程.β-actin基因标准曲线相关系数（R2）=0.9956,扩增效率（E） =96.93％;gpd基因标准曲线相关系数（R2） =0.9901,扩增效率（E） =93.78％;18S rRNA基因标准曲线相关系数（R2） =0.9981,扩增效率（E）=98.76％.3个基因片段的熔解曲线均呈单峰;扩增曲线呈典型的S型动力学曲线,指数期和平台期明显,为理想的熔解曲线和扩增曲线.用geNorm软件对三个管家基因的稳定性进行分析,三个基因的稳定性排序为β-actin＞ 18S rRNA＞ gpd,故β-actin和18S rRNA较适合作为研究法夫酵母JMU-MVP14定量实验的内参基因.     

卷枝毛霉孢子原生质体的制备与再生

为了构建高产γ-亚麻酸的卷枝毛霉稳定遗传转化体系,利用酶解法对卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)EIM-10的孢子进行原生质体制备。研究酶液组成、渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间等对卷枝毛霉孢子原生质体形成和再生的影响,建立了制备卷枝毛霉孢子原生质体的最适条件:1%纤维素酶和2%溶壁酶为酶解体系,0.5mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,酶解温度32℃,酶解时间2.5 h,再生培养基为0.5 mol/L NaCl高渗培养基。用双层平板培养法进行原生质体再生,在此条件下原生质体的形成量为1.2×106个/mL,再生率为70.5%。     

酸菜中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选和鉴定

从酸菜中分离筛选出产γ-氨基丁酸(GABA)乳酸菌18株,采用改良纸层析结合高效液相色谱法测定,获得1株高产乳酸菌菌株Lb-2,该Lb-2菌株在含10g/L谷氨酸钠的TYG培养基中静置培养48h,发酵液中GABA含量可达13.4g/L。根据乳酸菌的形态特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析鉴定Lb-2菌株为乳杆菌属(Lactobacillus)的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。     

基于18S rRNA和线粒体16S rRNA基因序列的柳蚕进化分析

为探讨柳蚕Actias selene Hübner与鳞翅目昆虫的系统发育关系,本研究利用PCR扩增获得了柳蚕核糖体18S rRNA和线粒体16S rRNA基因的部分序列,长度分别为391bp和428bp。并采用邻近距离法(NJ)、最大简约法(MP)、类平均聚类法(UPGMA)构建系统进化树。结果表明,柳蚕线粒体16SrRNA基因序列与大蚕蛾科昆虫的16SrRNA基因序列均表现出偏好于碱基AT的倾向。柳蚕与所研究的其它蚕类的遗传距离介于0.016至0.140之间,其中与温带柞蚕Antheraea roylii的遗传距离最小,与野桑蚕Bombyx mandarina的遗传距离最大。而基于鳞翅目昆虫18S rRNA基因部分序列的进化分析显示,柳蚕与柞蚕Antheraea pernyi之间的遗传距离最小(0.010),与蓖麻蚕Samia ricini的遗传距离最大(0.017)。     

Fatty acid production characteristics of fungi with particular emphasis on gamma linolenic acid production

The fatty acid production characteristics of fungi are described. These characteristics are the relationship between the oil content of the cell and the fatty acid content of the oil. For example, for polyunsaturated fatty acid (PUFA) production by Mucor hiemalis IPD 51, the oil content of the cell and the GLA content of the oil are coupled. For fungal production of some PUFA, synthesized after the rate-limiting step in the fatty acid anabolic chain, a maximum fatty acid production model was developed to link the fatty acid content of the oil and the oil content of the cell. Maximum volumetric productivity of gamma linolenic acid (GLA) by molds was found to occur at a specific GLA content of the oil. For example, for M. hiemalis IPD 51, a maximum volumetric of 4.7 mg GLA/L . h was produced at a GLA content of the oil of 8% to 10%. Similarly for Mucor circinelloides v. Tieghem IPD 155 a maximum volumetric productivity of 4.8 mg GLA/L . h was produced at a GLA content of the oil of 14% to 16%. These results imply that, when screening microorganisms for GLA or other fatty acid production, a number of medium compositions need to be evaluated to determine the tradeoff between oil content of the cell and fatty acid content of the oil. (c) 1993 John Wiley & Sons, Inc.     

一株乙醇降解菌株的分离和鉴定

从湖北农田土壤中筛选得到一株ALDH活性较高的菌株,该菌株在含0．64％乙醇的培养基中生长较佳,且耐受0．9％的乙醛。经菌种形态学和生理生化特征,以及16S rRNA基因序列分析,鉴定该菌株为不动杆（Acinetobacter sp．）。该菌株在乙醇和乙醛解毒研究中有重要价值。     

人工神经原网络处理PCR数据在细菌鉴定中的应用

目的16SrRNA和16S-23SrRNA间区片段是常用细菌分类鉴定靶点,本研究探讨人工神经原网络（ANN）对上述位点PCR扩增产物数据分析在细菌快速鉴定方面的价值。方法2对15SrRNA基因荧光引物和1对16S-23SrRNA区间基因引物用于扩增血液标本中分离出的317株细菌。相关毛细管电泳（CE）限制性片段长度多态性（RFLP）和单链构象多态性（SSCP）数据进行人工神经原网络分析。结果16S-23SrRNA基因的RFLP数据对未知菌鉴定的准确率高于16SrRNA基因的SSCP数据,分别为98．0％和79．6％。结论实验证明了人工神经原网络作为一种模式识别方法对于简化细菌鉴定十分有价值。