茄红素-β-环化酶反义基因对胡萝卜茄红素含量的影响

以根癌农杆菌GV3101为介导,用茄红素-β-环化酶(lycopene bate cyclase-LYC-B)5′端反义基因对胡萝卜(Daucus carotaL.var.sativa)进行了遗传转化,经胚发生途径得到抗性植株。GUS检测和Southern杂交表明目的基因已整合到胡萝卜基因组中,Dot Blot显示目的基因在受体植株中已表达,茄红素和胡萝卜素检测结果表明,转基因愈伤组织茄红素含量高于胡萝卜素含量。     

原壳小球藻番茄红素ε环化酶基因的克隆和分析

摘要：【目的】番茄红素ε环化酶（lycopene epsilon cyclase）是叶黄素代谢途径中处于分支位点的关键酶。它催化线性的番茄红素选择性环化,形成胡萝卜素,再进一步合成叶黄素（lutein）。本研究的目标是克隆原壳小球藻（Chlorella protothecoides CS-41）LCYE基因的全长cDNA,通过该基因的生物学信息分析预测其表达产物的空间结构与功能位点,并验证该表达产物的生物学活性。【方法】采用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends）和RT-PCR技术克隆原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA序列。分别采用PredictProtein、Pfam HMMs和Swiss-Model等在线分析软件分析LCYE的基本生物学信息,预测蛋白质功能位点和空间结构。利用pET28-a(+)构建LCYE基因的原核表达质粒pET-LCYE,并转入大肠杆菌BL21（DE3）,再利用IPTG诱导LCYE基因超量表达。此外,携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌能够积累番茄红素,可用于验证LCYE基因编码蛋白的酶活。【结果】获得了原壳小球藻的LCYE基因的cDNA序列,长2107 bp,GenBank登录号为FJ752528。序列分析表明：它含有1731 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码576个氨基酸,与高等植物和其他藻类的LCYE有很高的相似性,其中相似性最高的是莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii XM001696477.1）,达到67%。第48～459个氨基酸残基为一个典型的番茄红素环化酶蛋白（Lycopene cyclase protein）结构域（pfam05834）,第261～284个氨基酸残基为一个典型的环化酶保守的模体。SDS-PAGE检测表明,LCYE基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到了超量表达。携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌在获得LCYE基因后,其颜色从粉红色变为黄色。【结论】原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA为2107 bp,预测出番茄红素ε环化酶所特有的保守功能区域,构建了它的三维结构模型。同时,阐明了小球藻和衣藻的亲缘关系。最后,证实了本研究克隆到的LCYE基因编码的蛋白具有番茄红素ε环化酶的功能与活性。     

人类β-1,4-半乳糖苷转移酶Ⅲ基因的分离与克隆

以人、牛、鼠、鸡、蜗牛的β-1,4-半乳糖苷转移酶催化区的编码核苷酸序列为探针,在NCBI GenBank EST数据库中进行同源搜寻,获得若干有高度同源的EST.在拼接序列的两端设计引物,以从人胎盘cDNA文库中PCR扩增获得的片段为探针,在人胎盘cDNA分子库中步移获得一个长1,907bp的cDNA片段,包含一个长1,179bp的开放阅读框(ORF,open reading frame),编码393个氨基酸残基。该基因与已知的人类β1,4-GalTI的氨基酸同源性为43.8%,在蛋白质催化区的同源性更高达60.9%。表达谱分析发现该基因在人体16种组织中均有不同程度的表达,转录本大小约为2.4kb.通过该cDNA人/啮齿类杂种细胞株DNA Southern杂交将该基因定位在1号染色体。     

纽荷尔脐橙CCS基因的克隆与分析

利用RT-PCR技术从纽荷尔脐橙果实cDNA中分离出辣椒红／辣椒玉红素合成酶（Capsanthin/Capsorubin synthase,CCS）基因（Ccs）全长。该片断长为1619bp,编码503个氨基酸。BLAST比较其氨基酸同源性发现,该序列所推导的氨基酸与已知的甜橙CCS完全一致,与胡萝卜和辣椒的CCS,以及马铃薯新黄质合成酶（neoxanthin synthase,NSY）有70％的同源性。此外,与番茄和柑橘等的番茄红素环化酶也有50%~70%的同源性。半定量RT-PCR分析表明,Ccs在纽荷尔脐橙果实成熟过程中呈先上升后下降的表达趋势,期间9月份的表达量最高。     

番茄交替氧化酶基因的克隆和表达

利用简并PCR扩增产物做探针筛选番茄cDNA基因文库获得一个全长交替氧化酶cDNA基因LeAoxlau.经序列分析得出,该基因全长1 418bp,编码区序列长1 077 bp,编码约40 kD的前体蛋白.该蛋白在转运到线粒体时被加工成32kD的成熟蛋白.Southern印迹杂交分析结果显示该基因以单拷贝形式存在于番茄的基因组中RT-PCR显示,该基因在在番茄植株的根、茎、叶和子叶中表达.重组表达实验表明该基因能在大肠杆菌中表达.     

菘蓝CYP83B1基因的克隆与表达分析

对菘蓝（Isatis indigotica Fort.）CYP83B1基因进行了克隆与表达模式分析。结果显示,IiCYP83B1基因全长为1652 bp,包含2个外显子和1个内含子;cDNA全长为1500 bp,编码499个氨基酸。IiCYP83B1编码的蛋白没有跨膜结构域和信号肽,主要定位于内质网膜,属于亲水性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲螺旋和α-螺旋组成,与萝卜（Raphanus sativus Linn.）、欧洲油菜（Brassica napus L.）、甘蓝（Brassica oleracea L.）和芜菁（Brassica rapa L.）等植物的CYP83B1蛋白具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果表明,IiCYP83B1基因在菘蓝的根、茎、叶、花和果中均有表达,且以叶中的表达量最高;在幼苗期、生长期和花期稳定表达且均显著高于萌芽期;茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和葡萄糖（glucose,Glu）能够显著促进该基因的表达,而低温（4℃）和水杨酸（salicylic acid,SA）处理对其表达具有一定的抑制效应。本研究结果可为进一步探讨IiCYP83B1基因的功能提供参考。     

草地螟羧肽酶A基因的克隆、表达及序列分析

羧肽酶是昆虫体内重要的消化酶系之一。利用甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）围食膜多克隆抗体免疫筛选草地螟Loxostege sticticalis L.中肠cDNA表达文库, 得到编码羧肽酶A的全长cDNA克隆。该cDNA克隆全长1 380 bp （GenBank登录号EU924506）, 开放阅读框长1 302 bp, 编码434个氨基酸, 预测分子量和等电点分别为49.1 kDa和9.56。序列含有胰蛋白酶切割位点和催化特征, 具有典型的羧肽酶A特性。将该基因与pET30载体重组后, 经IPTG诱导, 蛋白在大肠杆菌中获得了表达。     

中国红豆杉紫杉烯合酶cDNA的分离、表达和鉴定

紫杉烯合酶是一种二萜环化酶,催化牛儿基牛儿基焦磷酸形成紫杉醇生物合成过程中的中间体紫杉烯.利用PCR扩增同源探针筛选cDNA文库,克隆了一个编码中国红豆杉(Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.)紫杉烯合酶3′端的2 151 bp的cDNA片段,也通过PCR扩增得到了该基因5′端的611 bp的cDNA片段,将这两个cDNA片段拼接在一起,得到长2 712 bp的cDNA片段,具有一个2 586个碱基的开放阅读框架(ORF),编码包括质体转移肽在内的共862个氨基酸残基;该酶与太平洋红豆杉紫杉烯合酶有97%的同源性(identity),与其他植物萜类环化酶也有较高的同源性.利用融合表达载体pET-32a在大肠杆菌BL21trxB中表达,所表达的融合蛋白以包含体形式存在.包含体经过变性、复性和再折叠,利用His残基亲和凝胶柱层析得到融合的紫杉烯合酶.用毛细管气相色谱-质谱联用对酶促反应产物进行分析,结果表明,融合的紫杉烯合酶能催化产生4(5),11(12)-紫杉烯.     

花生AhRab7基因的克隆及其原核表达研究

为了研究花生小G蛋白AhRab7基因在大肠杆菌中的表达模式及与高盐胁迫的关联性,采用 RT-PCR技术从花生（Arachis hypogaea L .）品种花育20中克隆了AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长序列,通过核苷酸序列和氨基酸序列分析结果表明AhRab7的cDNA全长分别为872 bp、816 bp,分别含一个621 bp、618 bp大小的开放阅读框（ORF）,拟编码氨基酸数分别为206 aa、205 aa。将携带完整的ORF序列连入表达载体 pET-28a(+)中,经IPTG诱导后进行耐盐性测定,结果表明两种全长重组酶（分别含pET-Rab 7-1 和pET-Rab 7-2的重组质粒）均具有正常酶活性,明显缓解了高盐环境(5.5%～10% NaCl溶液)对大肠杆菌的生长胁迫,而对照组（含空载体pET-28a）未能检测出相同的酶活性,结果表明该基因表达可以缓解高盐胁迫影响。目的基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小为23KDa,与预测结果一致。这为后期探讨花生对盐胁迫及其他非生物胁迫的研究奠定了一定的基础。     

黄秋葵番茄红素β-环化酶LCYB基因的克隆与分析

应用RT-PCR和RACE技术克隆得到cDNA全长1797 bp的黄秋葵(Hibiscus esculentus L.)番茄红素β-环化酶基因LCYB,开放阅读框(ORF)包含1509个碱基;预测编码503个氨基酸,理论分子量(Mw)为56.288 kD,等电点(p I)为4.577;编码的蛋白与陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、黄麻(Corchorus capsularis L.)和可可(Theobroma cacao L.)同源蛋白的相似性均在88%以上,显示其高度的保守性,将基因命名为HeLCYB,GenBank登录号为:KX257998。Motif Scan分析显示,蛋白氨基酸序列88~481位为HeLCYB保守结构域,并在88~113位含有1个FAD结合域。通过荧光定量PCR分析表明,HeLCYB基因在黄秋葵根、茎、叶、花和果荚中均有表达;叶片生长中以成熟叶中表达最高,果实发育中以花后7d高表达。建立与优化了黄秋葵类胡萝卜素超高效液相检测体系,结果显示黄秋葵中主要含有β-胡萝卜素和叶黄素。β-胡萝卜素在成熟叶中含量最高,果实以花后7 d含量最高,与HeLCYB基因的表达呈正相关。本研究揭示了HeLCYB基因表达和类胡萝卜素积累的特性,为开展黄秋葵类胡萝卜素分子调控机制研究奠定了基础。     

胡萝卜DcPAB基因的分离及其结构与功能分析

运用改进的减法杂交技术分离到胡萝卜Poly(A)结合蛋白基因DcPAB .其cDNA编码区长度为 1 977bp ,编码 6 5 8个氨基酸和 1个终止密码子 .基因组转录序列区长度为 4 6 1 6bp ,包含 9个外显子和 8个内含子 .DcPAB在胡萝卜基因组中为单拷贝基因 .该基因在胡萝卜体细胞胚中特异性表达 ,且其表达活性在调控 解调控前后有明显差异 .体外结合实验表明 ,在大肠杆菌中表达并纯化的DcPAB蛋白具有与oligo(A) 2 0 特异性结合的性能 .酵母突变体互补实验进一步证明 ,该基因可以互补PAB基因缺失的酵母突变体的功能缺陷     

二色补血草液泡膜H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个V-H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因全长cDNA序列。该基因全长为729bp。其中,开放读码框（ORF）为498bp,编码165个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为16.6kDa,理论等电点为8.62。用实时定量RT-PCR方法进一步研究二色补血草在NaCl、NaHCO3和NaCO3胁迫下的不同时间内该基因表达模式的结果表明,NaCl强烈诱导二色补血草叶组织中LbVHA-C基因的表达,但其根部的表达变化不明显。NaHCO3胁迫下LbVHA-C基因在根部组织的表达受抑制。Na2CO3胁迫24h时的LbVHA-C基因在根和叶部组织中的表达都强烈受抑制,随后在根和叶组织的表达量逐步升高。     

枣果实β-半乳糖苷酶基因的克隆及表达分析

采用3-′RACE技术获得了梨枣果实β-半乳糖苷酶(-βGal)基因的部分cDNA片段,并运用实时荧光定量PCR技术和PNPG反应比色法,研究了梨枣不同生长期及采后常温贮藏过程中ZJGAL基因的相对表达量和β-Gal活性的变化,以探索β-半乳糖苷酶在枣(Ziziphus jujubaMill.)果实生长及采后软化中的分子调控机制.结果表明,克隆的-βGal基因序列长2 584 bp(GenBank登录号HQ827769),其中包含2 193 bp的最大阅读框,编码730个氨基酸,将该基因命名为ZJGAL.Blastn和Blastp序列比对分析发现,该ZJGAL基因与已登录的其他物种的β-Gal基因相似性达到60%～80%.随着果实的生长、成熟及采后衰老,ZJGAL基因的表达量和-βGal活性在果实采收前后均呈先上升后下降的趋势,两者的采前高峰均在幼果膨大期,但是采后贮藏过程中虽然基因的表达量较高,但是-βGal活性一直较低.     

心脏发育候选基因AHNAKβ的克隆和表达研究

心脏发育过程是一个错综复杂的过程,由一系列的基因参与完成.虽然目前已经鉴定出很多与心脏发育相关的基因,但是仍有很多心脏发育相关基因有待鉴定.作者从小鼠心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个心脏发育候选基因AHNAKβ.AHNAKβ位于11q12.2,长1 064 bp,由6个外显子和5个内含子组成,其中开放阅读框(ORF)长450 bp (258~710 nt),编码含有149个氨基酸,蛋白质大小约为16.0 kD.我们构建了原核细胞表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化了GST- AHNAKβ融合蛋白,然后制备了该蛋白的兔免疫血清.利用该抗体进行了小鼠成体组织Western blot以分析该基因的蛋白表达模式.研究结果表明AHNAKβ在小鼠成体子宫、小肠等多种组织表达,在心脏中表达较高,提示它可能在心脏组织中具有某种重要作用.     

油菜BnHMGB2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的BnHMGB2基因的cDNA,全长823 bp,其中包括438 bp的开放阅读框,131 bp的5′非翻译区（5′UTR）,253 bp的3′非翻译区（3′UTR）。与拟南芥AtHMGB2的同源性达到了87.4%,因此命名为BnHMGB2(GenBank登录号：JN807314)。该基因编码145个氨基酸的蛋白质,分子量15.9 KDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR结果表明该基因在油菜根、茎、叶、下胚轴均有表达,根中表达量最高。同时,该基因的表达受低温胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

胡萝卜肉桂醇脱氢酶基因的克隆及其对非生物胁迫的响应

该实验采用RT PCR技术,从胡萝卜‘黑田五寸’中克隆获得了编码肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD）的基因DcCAD。DcCAD序列长1 074 bp,编码357个氨基酸。亲水/疏水性分析表明,DcCAD属于亲水性蛋白。系统进化分析显示,DcCAD与番茄CAD（XP_010314515.1）亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,DcCAD基因在胡萝卜根、叶片和叶柄中的表达量差异显著,其相对表达量为叶片＞根＞叶柄。DcCAD基因对高温（38 ℃）、低温（4 ℃）、干旱（20% PEG）和盐（0.2 mol·L^-1 NaCl）胁迫均有响应,尤其对高温胁迫和低温胁迫响应明显,而且高温处理后1 h和低温处理后2 h表达量最高。研究推测,DcCAD基因对胡萝卜抗逆性具有一定的作用。     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

利用RACE技术扩增大豆抗病基因同源cDNA 5′末端序列

利用抗病基因保守序列筛选大豆cDNA文库,获得一抗病基因同源cDNA片段,命名为KR3-1。根据KR3-1设计两个基因特异引物（GSP 和 NGSP）,分别与通用引物(UPM)和巢式通用引物（NUP）共同扩增,成功地克隆到了该基因的5′末端序列。该扩增片段长447 bp,与已知序列重叠部分为129 bp。 Abstract:Based on part of a known partial cDNA sequence of a disease resistance gene homolog,KR3-1,obtained by screening a cDNA library from soybean,5′-RACE-PCR was carried out with gene specific primers and universal primers.After the nested PCR reaction,an amplified fragment of 447 bp in length which overlapped the known KR3-1 sequence by 129 bp was obtained subsequently.Thus,a 5′ cDNA end of KR3 was successfully cloned.     

虾夷扇贝β-actin基因的克隆和序列分析

为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5′端测序,比对,筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。肌动蛋白基因cDNA全长1536bp(不包括polyA),5′端非编码区84bp,3′端非翻译区321bp,阅读框1131bp,编码377个氨基酸。在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。系统发育分析显示该肌动蛋白属于β类型。本研究得到的虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其它功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。     

苎麻抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆和表达分析

本研究根据苎麻转录组测序结果中的抗坏血酸过氧化物酶（APX）的基因片段,利用RT-PCR结合RACE方法从苎麻（Boehmeria nivea L.）中克隆到一个APX基因的全长cDNA,命名为BnAPX1。BnAPX1 cDNA全长1 201 bp,开放阅读框(ORF)为870 bp,推测其编码一个含289个氨基酸序列的多肽。生物信息学分析表明,BnAPX1属于植物过氧化物酶超家族成员,与其他物种过氧化物酶体APX相似性较高,C端具1个跨膜区。荧光定量PCR结果表明,BnAPX1在苎麻的根、茎中段、茎尖、茎皮、幼叶各部位均有表达,其中幼叶表达量最高,且该基因BnAPX1受重金属镉诱导上调表达,可能在重金属镉胁迫防御中起重要作用。