人组氨酸磷酸酶PHP14的原核表达及其体外互作蛋白的研究

目的:表达和纯化人组氨酸磷酸酶PHP14蛋白,并寻找与其存在体外相互作用的蛋白。方法:PCR扩增PHP14的全长cDNA,并将其克隆至pGEX4T原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione Sepharose 4B凝胶颗粒进行亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳确定融合蛋白的表达。进行GST-Pulldown实验,寻找体外与PHP14相互作用的蛋白,并进行质谱鉴定。结果:在大肠杆菌BL21中成功了表达出了PHP14的可溶性融合蛋白;经Glutathione Sepharose4B凝胶颗粒纯化后,获得了纯化的GST-PHP14融合蛋白,GST-Pulldown实验和质谱鉴定结果发现PHP14与HSP90在体外存在相互作用。结论:实现了PHP14的原核表达和纯化,发现PHP14与HSP90在体外可能存在相互作用。     

烟草曲茎病毒复制蛋白基因的原核表达和免疫定位

利用PCR方法从烟草曲茎病毒 (TbCSV)Y35分离物的病株中获得复制蛋白 (Rep)基因 ,将其克隆到原核表达载体pGEX 4T 1上获得重组质粒pGEX Y35Rep。重组质粒导入大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中 ,IPTG诱导表达后发现部分Rep融合蛋白以可溶性形式表达。利用GST Sepharose 4B亲和层析柱纯化了Rep的融合蛋白 ,免疫家兔获得Rep蛋白的抗体。对TbCSV侵染烟草中Rep蛋白的亚细胞分布研究发现 ,Rep蛋白主要分布于含有细胞核的组份中。利用免疫胶体金技术对感病烟草中Rep蛋白进行了定位 ,发现Rep蛋白存在于细胞核内     

猴免疫缺陷病毒衣壳蛋白p27在大肠杆菌中的表达及纯化

目的获得用于SIV检测的衣壳蛋白p27重组抗原。方法利用生物信息学软件选择衣壳蛋白p27抗原表位集中的区域,合成SIV p27基因;将该基因与pMAL-p5x载体连接构建pMAL-p5x-p27重组质粒,并转化大肠杆菌BL21中,诱导表达;用Amylose Resin亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果 SDS-PAGE分析显示,pMAL-p5x-p27重组质粒可在大肠杆菌中高效表达,表达产物分子量约为70×103;经纯化获得目的蛋白p27纯度可达90%。结论本研究利用原核表达系统成功表达了SIV p27蛋白,为SIV检测方法的建立奠定了基础。     

人热休克蛋白70和热休克固有蛋白70的基因克隆和表达

目的:克隆人热休克蛋白70(HSP70)和热休克固有蛋白70(HSC70)基因,并在大肠杆茵中表达,获得重组蛋白.方法:用RT-PCR法从HepG2细胞中扩增HSP70及HSC70cDNA序列.测序后,将相应的cDNA插入pRSET-A表达载体,在大肠杆菌中表达,重组蛋白纯化后用SDS-PAGE及Western Blotting分析.结果:DNA序列结果显示.本研究所获得的HSP70及HSC70 cDNA序列与参考序列一致.将全长cDNA分别插入表达质粒后,转化BL21(DE3)细菌,在IPTG的诱导下,表达产物SDS-PAGE显示相应的分子量(70kDa)位置有明显的蛋白条带.Western Blotting结果证实了其为目的蛋白,经镍树脂柱纯化,获得了相应的重组多肽.结论:成功构建了原核表达重组质粒HSP70-pRSET-A和HSC70-pRSET-A,并获得了纯化的重组人HSP70和HSC70蛋白,为进一步研究这两种蛋白的结构、功能及临床应用奠定了基础.     

Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

胞壁表达HSP65-IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建和鉴定

目的：获得胞壁表达结核分枝杆菌热激蛋白65（HSP65）和人白细胞介素2（IL-2）融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法：将HSP65和IL-2融合基因克隆入大肠杆菌-卡介苗（E．coli-BCG）穿梭质粒pCW,构建成重组质粒HSP65-IL-2-pCW,电穿入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选和PCR方法选取阳性克隆;用间接免疫荧光法对重组耻垢分枝杆菌进行表型鉴定;用重组耻垢分枝杆菌免疫BALB／c小鼠,检测其诱导的抗体水平。结果：筛选获得的重组耻垢分枝杆菌增殖特性与普通耻垢分枝杆菌无明显区别;与抗人的IL-2抗体和HSP65抗体均可形成免疫印迹条带;间接荧光染色后,可见细菌表面有极强的绿色荧光;重组耻垢分枝杆菌免疫BALB／c小鼠2周后,小鼠血清中HSP65抗体平均滴度为1：4000,而生理盐水组的抗体几乎为阴性。结论：结核分枝杆菌HSP65和人IL-2融合基因在耻垢分枝杆菌胞壁获得表达,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。     

日本鳗鲡绿色荧光蛋白基因的克隆与表达

[目的]克隆日本鳗鲡绿色荧光蛋白UnaG基因,表达并纯化UnaG蛋白。[方法]从日本鳗鲡中克隆了绿色荧光UnaG基因,并克隆至p ET28Aa、pc DNA-Flag质粒中。将重组质粒pc DNA-Flag用脂质体转染到293T细胞中,用荧光显微镜观察绿色荧光,同时用原核表达系统诱导His-UnaG融合蛋白的表达,用亲和层析和凝胶过滤层析纯化HisUnaGg融合蛋白。[结果]转染人293T细胞后不到24 h,荧光显微镜观察到日本鳗鲡UnaG能被激发出较强的绿色荧光;原核表达并纯化的His-UnaG融合蛋白纯度很高,Western Blot检测为单一条带,蛋白量达3μg/μl。[结论]成功克隆并纯化了UnaG,为进一步研究UnaG的应用奠定基础。     

卵泡刺激素受体短肽的表达及纯化

目的:表达人卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)N端第18-34氨基酸片段.方法:将FSHR N端第18-34氨基酸片段克隆p-pGEX4T-1中,构建成重组质粒pGEX4T-1-FSHRN(18-34位氨基酸).将该重组质粒转化E.coli BL21后,IPTG诱导其表达,经亲和层析进行分离纯化,western blot鉴定.结果:克隆成功,并表达FSHRN端第18-34氨基酸片段,所表达的融合蛋白中60%为可溶性蛋白.结论:成功克隆、表达、纯化了人FSHRN端第18-34氨基酸片段,为后续动物免疫试验提供抗原.     

新型瞬时报告载体pRSET-EGFP的构建及表达

目的：利用分子生物学技术和方法将pRSET-B质粒改建为带有绿色荧光蛋白(GFP)突变体基因(GFP-S65T)的新型瞬时表达载体pRSET-EGFP,并在E．coli．BL21中得到GFP基因的高效表达。方法：PCR法从pEGFP质粒克隆GFP-S65T cDNA并在5’末端引入KpnⅠ的位点。将扩增出来的GFP-S65T基因和pRSEY-B质粒用HindⅢ和KpnⅠ双酶切后连接构成重组质粒。用化学法把重组质粒转化到E．coli．BL21中,培养发酵液。OD540=0．4时加入IPTG诱导GFP-S65T基因转录和表达,合成绿色荧光蛋白。还对诱导条件进行了优化,发酵液OD540=0．4加入IPTG可以得到最优表达。结果：通过Ni^2 柱亲和层析,纯化得到绿色荧光蛋白,SDS-PAGE电泳检测,分子量为27kDa,与文献报道值一致。这说明Ni^2 柱能够有效的纯化表达产物。结论：成功构建了新型瞬时表达载体pRSET-EGFP,并且在E．coli．BL21中得到高效表达。     

鲍曼不动杆菌MsrA蛋白原核表达载体的构建、纯化及氧化应激条件下的表达

目的以鲍曼不动杆菌甲硫氨酸亚砜还原酶A(methionine sulfoxide reductase A,MsrA)构建p ET28a-MsrA并表达、纯化原核表达重组质粒,观察在氧化应激条件下MsrA的表达水平,为其抗氧化功能的研究提供依据。方法设计并合成分别带NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的MsrA引物,用PCR方法扩增MsrA基因,构建p ET28a-MsrA重组质粒并转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组MsrA蛋白表达,经Ni2+亲和层析分离纯化。利用荧光定量PCR方法,观察在氧化应激条件下MsrA蛋白的表达量。结果构建了编码MsrA蛋白的重组质粒p ET28a-MsrA,SDS-PAGE显示在相对分子质量约22 000处有一明显条带的重组MsrA蛋白,并利用Ni2+亲和层析柱纯化获得纯度较高的MsrA蛋白。氧化应激也可快速诱导MsrA蛋白的表达。结论成功构建了p ET28a-MsrA重组质粒及表达纯化系统,且氧化应激条件下MsrA蛋白表达上调。     

大鼠热休克蛋白70的融合表达及纯化鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化大鼠热休克蛋白（HSP）70与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白,以进一步研究细胞外HSfr70的生物学功能。方法：用RT-PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体转化大肠杆菌B121,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,建立最佳诱导表达条件;采用Amylose树脂预装柱对目的蛋白进行亲和纯化,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果：克隆出目的基因,构建了融合表达载体pMAL-c2X／hsp70;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带,并纯化出纯度较高的融合蛋白;免疫印迹鉴定表明其具有抗原活性。结论：在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白MBP-HSP70,为进一步研究细胞外HSP70的生物学效应提供了有用的材料。     

禽多杀性巴氏杆菌P1059成熟黏附蛋白的原核表达、纯化和抗原性检测

目的：建立rCPM36在大肠杆菌中的表达体系,纯化表达产物并检测其抗原性。方法：运用PCR方法从禽多杀性巴氏杆菌国际标准株P1059基因组中扩增出编码36kDa成熟黏附蛋白的cpm36基因,构建原核表达载体pQE30-cpm36,转化到大肠杆菌M15中并诱导表达目的蛋白,用镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白及制备其抗体,Western印迹分析其抗原性。结果：SDS-PAGE结果显示目标蛋白以可溶性形式表达在大肠杆菌M15细胞质中,其相对分子质量为37kDa,Western印迹结果表明表达蛋白具有良好的抗原性。结论：成功构建出原核表达载体并实现了目的蛋白表达,用镍离子螯合层析柱纯化得到具有抗原性的蛋白,为进一步开展禽多杀性巴氏杆菌黏附因子和保护性抗原的研究奠定基础。     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c 的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。     

P277多肽融合热休克蛋白65提高抗1型糖尿病的作用

为了提高P277肽抗1型糖尿病的作用, 把P277肽融合在卡介苗热休克蛋白65的C端, 构建了pET28a- HSP65-P277高效表达载体, 在大肠杆菌中高效可溶性表达。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析分离纯化了融合蛋白HSP65-P277。使用HSP65-P277在没有任何佐剂存在的情况下免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠, 通过三次腹腔注射, 每月收集被免疫动物的血清, 血糖浓度用自动生化分析仪测定。结果显示HSP65-P277免疫组小鼠血糖平均值及糖尿病的累积发病率和其余组相比均有显著差异(P<0.01), 融合蛋白HSP65-P277抗NOD小鼠糖尿病的作用显著高于单独的P277和HSP65。为进一步开发能用于临床的1型糖尿病疫苗提供了良好的设计思路, HSP65-P277极有可能进一步发展成为新的抗I型糖尿病的疫苗。     

P277多肽融合热休克蛋白65提高抗1型糖尿病的作用

为了提高P277肽抗1型糖尿病的作用, 把P277肽融合在卡介苗热休克蛋白65的C端, 构建了pET28a- HSP65-P277高效表达载体, 在大肠杆菌中高效可溶性表达。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析分离纯化了融合蛋白HSP65-P277。使用HSP65-P277在没有任何佐剂存在的情况下免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠, 通过三次腹腔注射, 每月收集被免疫动物的血清, 血糖浓度用自动生化分析仪测定。结果显示HSP65-P277免疫组小鼠血糖平均值及糖尿病的累积发病率和其余组相比均有显著差异(P<0.01), 融合蛋白HSP65-P277抗NOD小鼠糖尿病的作用显著高于单独的P277和HSP65。为进一步开发能用于临床的1型糖尿病疫苗提供了良好的设计思路, HSP65-P277极有可能进一步发展成为新的抗I型糖尿病的疫苗。     

牛γ-干扰素在大肠杆菌中的表达及抗原性鉴定

目的在大肠杆菌中高效表达牛γ-干扰素（bovine interferon-γ,BovIFN-γ）,并对其生物活性进行初步鉴定。方法依据GenBank上基因序列人工合成BovIFN-γ基因,PCR方法扩增该基因,将其插入PET-28a载体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21中,在IPTG诱导下表达BovIFN-γ,并进行Western blot鉴定。Ni-NTA亲和层析法和电洗脱方法纯化表达的重组蛋白,用Western blot和商品化的BovIFN-γ检测试剂盒进行重组蛋白的抗原性检测。结果成功构建了BovIFN-γ原核表达载体PET-28a-BIFN-γ,并在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的32%,表达产物主要以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中;重组蛋白可与BovIFN-γ单克隆抗体反应,Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白抗原活性比电洗脱方法纯化的抗原活性高。结论在大肠杆菌中成功表达了可溶性的BovIFN-γ蛋白,可与BovIFN-γ单抗发生反应,纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。     

Isolation and characterization of human HSP70 expressed in Escherichia coli

A plasmid containing the human HSP70 gene was used to transfect and express the protein in Escherichia coli. The bacterial product was a fusion protein containing 640 amino acids of HSP70, plus 33 additional NH2 terminal amino acids; 12 from the bacterial expression vector and 21 from a 5' human sequence that is not normally translated. It was partially purified by ion-exchange and ATP-Sepharose affinity column chromatography. The bacterially produced human HSP70 protein was then compared with HSP70 obtained from cultured 293 cells. Both shared the same staphylococcal V8 protease peptide fragment pattern, ATP binding, and a weak ATPase activity (about 10-15 nmol ATP hydrolyzed per milligram protein per minute at 30 degrees C). The bacterially produced human HSP70 protein differed in its V8 protease pattern with an E. coli ATP-binding protein that corresponded in molecular mass to the E. coli dnaK gene product. Mutants in the human HSP70 gene were constructed which significantly reduced a predicted major alpha-helical domain in the HSP70 molecule that has partial homology to an ATP-binding site of several protein kinases. One HSP70 mutant clone contained a deletion of 20% at the NH2 terminus, and expressed a 57-kDa product, while the other was missing the middle 50% of the gene (40-kDa product). Neither protein fragment bound to an ATP affinity column, suggesting that ATP binding to HSP70 may be conformationally affected by a region about 20% internal to the NH2 terminal end of the molecule. Recently, a similar location of the ATP-binding site has been reported by Milarski and Morimoto (27).