肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

肝特异性表达HCV5＇NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的.以2235A-1质粒为模板,通过PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段,用小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段取代pHCV-neo4质粒(含HCV5＇NCR调控荧光素酶基因)的CMV启动子,构建了一种白蛋白启动子启动转录的HCV5＇NCR调控荧光素酶表达质粒(pA1b-HCV).该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高,表明成功地构建了肝特异性表达的HCv5＇NCR调控荧光素酶表达质粒.该研究为建立肝特异性表达的HCV5＇NCR转基因小鼠模型奠定了基础,对评价HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义.     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5′NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5′端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用。方法:以质粒pCMVN CRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5′端20nt和43nt的HCV 5′NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5′NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5′NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCN1-d1、pCNl-d2)。以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平。结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功。各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNRluc相比差异无显著性(P＞0．05);pCNl-dl、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0．05)。结论:HCV 5′NCR的5′端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性。     

丙型肝炎病毒特异性核酶对HepG2.9706细胞HCV5′NCR基因表达的抑制作用

 为探讨锤头型核酶抗丙型肝炎病毒的作用 ,根据HCV 5′NCR及翻译起始区的二级结构 ,设计及合成了 1个锤头型核酶RzA .将其插入pCI neo表达载体的多克隆位点 ,构建了表达RzA的质粒pHCV RzA .采用转基因细胞模型HepG2 970 6细胞 ,评价了pHCV RzA质粒对HCV 5′NCR调控荧光素酶表达的抑制活性 .结果表明 ,在HepG2 970 6细胞中 ,pHCV RzA以序列特异性、剂量依赖性方式抑制荧光素酶基因的表达 ,抑制率达 80 % ,提示核酶有可能作为HCV感染基因治疗的一种有效途径 .     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5＇NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

可调控肝脏特异性表达HCV全基因转基因小鼠模型的建立

目的:构建一种可调控肝细胞特异性表达丙型肝炎病毒(HCV)全基因的小动物模型。方法:将9.6 kb的HCV全长基因JFH1插入Tet-on系统效应表达载体p TRE2中,并在HCV全基因3'端插入丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列,从而构建转基因载体p TRE2-JFH1(HCV);将该转基因载体线性化后显微注射获得整合有HCV全基因的TRE2-HCV首建鼠;将该阳性鼠与本室保存的Alb-rt TA转基因小鼠杂交,获得肝细胞白蛋白启动子调控HCV全基因表达的Tet-on-Alb-HCV双转基因小鼠;在强力霉素(Dox)诱导后通过PCR、Western印迹、免疫组化等方法鉴定转基因小鼠HCV基因整合及HCV蛋白在肝组织中的表达;实时定量PCR检测小鼠血清及肝组织中的HCV滴度;用HCV反义小分子药物anti-mi R122评价该模型在药物评价中的应用。结果:获得了整合rt TA基因和HCV全长基因的双转基因小鼠;Dox诱导下,该转基因小鼠可在肝组织长期特异性表达HCV全长基因,小鼠血清中可检测到HCV的RNA;分子药物anti-mi R122可降低血清中的HCV滴度。结论:构建了可调控肝组织特异性表达HCV全基因的转基因小鼠模型,该小鼠模型可应用于HCV药物筛选和评价研究。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5''NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法:以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5'端20nt和43nt的HCV 5'NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5'NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCNl-d1、pCNl-d2).以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性(P＞0.05);pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0.05).结论:HCV 5NCR的5'端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

HCV特异性反义RNA表达载体的构建及活性评价

反义RNA是反义技术的一个重要领域,为探索丙型肝炎病毒治疗新途径及验证转基因细胞模型HepG2.9706的有效性,设计了一条互补于HCV 5′NCR及翻译起始区(39713核苷酸)的反义RNA序列,将其插入pGL3载体SV40启动子下游,构建了HCV特异性的反义RNA真核表达载体(pHCV-asR)。通过PCR扩增、酶切反应及序列分析进行了初步鉴定,并将其转染HepG2细胞,通过RTPCR方法检测其在细胞中的表达并将pHCV-asR转染转基因细胞模型HepG2.9706,评价其对HCV 5′NCR的抑制活性。结果表明,构建的反义RNA表达载体插入序列正确,并能在HepG2细胞中表达;pHCV-asR在HepG2.9706中对HCV 5′NCR调控荧光素酶基因表达具有特异性的剂量依赖性抑制活性,最高抑制率可达57%。     

HCV 5′NCR转基因细胞HepG2.9706的特性分析

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的威胁人类健康的重要传染病,迄今尚无有效的疫苗及特异性抗病毒治疗药物.抗HCV药物的研究和开发面临的关键问题是缺乏合适的HCV感染细胞及动物评价模型.转基因细胞模型是研究人类疾病常用的有效手段,因此,在HCV分子生物学进展的基础上,我们以对HCV翻译与复制有明显调控功能的HCV 5′NCR及部分翻译起始区序列为靶标,构建了HCV 5′NCR及部分多聚蛋白起始区序列与荧光素酶基因的融合基因,插入真核表达载体,转染HepG2细胞,获得了HCV 5′NCR转基因细胞HepG2.9706细胞株[1].本文对该细胞的某些特性进行了分析,以便更好地利用该细胞模型进行药物评价.     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

利用脊髓灰质炎病毒5＇NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒.体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质粒可表达RNA聚合酶.将PV的5＇NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒;用LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREEN LANTERN-1和pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒上,构建成 pLacZ LANTERN-1和pLacZ LANTERN-1-5＇NCR质粒.表达RNA聚合酶的质粒与pLacZ 5＇NCR调控表达报告基因的质粒共转染,明显提高了报告基因的表达水平,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体.     

hhlim基因转录调控区域鉴定及表达调控的初步研究

为了研究hhlim基因表达调控机制,对该基因5′上游－2 537 bp序列从5′端依次进行缺失后,利用荧光素酶报告基因检测各种不同长度片段在C2C12细胞中驱动荧光素酶表达的活性.结果表明,在hhlim基因5′上游－2 537～－1 537 bp之间存在负调控元件,在－253～－157 bp之间含有增强子样序列.用含有增强子样序列的DNA片段做探针,对未分化型和分化型C2C12细胞的核蛋白进行电泳迁移率改变分析(electrophoretic mopility shift assay, EMSA).分析的结果显示,两种表型细胞中的核蛋白与探针结合所形成滞后带的谱型明显不同.结果还发现内皮素-1(ET-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)既能显著诱导C2C12细胞对hhlim的表达,也能刺激含增强子样序列的调控区域所驱动的报告基因表达.提示hhlim基因转录起始点至－2 537 bp的区域内含有负调控元件及增强子样序列,该基因的表达受ET-1和bFGF的调节.     

p53过表达抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性

NKX3.1是前列腺特异表达的同源盒基因,在前列腺癌的发生发展中起重要作用,而在前列腺癌进展中常会发生p53的基因突变.为研究两者之间的关系,构建NKX-3.1启动子(1 040bp)-荧光素酶报告基因重组质粒（pGL3-1040）及其缺失突变体,瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP.通过荧光素酶表达活性分析,检测p53过表达对NKX3.1启动子活性的影响.结果表明：p53在LNCaP细胞中过表达可明显抑制NKX3.1启动子活性;RT-PCR及Western印迹检测p53过表达对NKX3.1表达的影响.结果表明,p53过表达可以明显抑制同源盒基因NKX3.1的表达.通过TRANSFAC软件分析,在NKX3.1基因上游-526至-507区存在一个p53反应元件的5′核心序列.缺失pGL3-1040中的p53反应元件核心序列并不能消除p53对NKX3.1启动子的抑制作用,表明p53不是通过p53反应元件直接抑制NKX3.1启动子活性.进一步通过5′缺失突变分析,发现NKX3.1启动子-140～+8 bp区仍受p53负调控.此148 bp区域中含有一个Sp1和一个CREB元件,瞬时共转染Sp1表达载体或CREB表达载体的结果表明,p53并不是通过与Sp1或CREB相互作用对NKX3.1启动子发挥抑制作用的.上述结果表明,p53过表达可以抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性,下调NKX3.1基因的转录,其调控机制有待进一步研究.     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

北极狐β-防御素103基因 (CBD103) 启动子活性及转录调控元件分析

本研究旨在筛选调控北极狐毛色基因CBD103的启动子活性区域及转录因子结合位点,为揭示CBD103基因调控北极狐毛色形成的分子遗传机制提供依据。克隆获得了北极狐CBD103基因5′侧翼区2 123 bp的片段,并构建了4个不同长度的启动子缺失片段表达载体,通过双荧光素酶检测系统对启动子活性进行检测。对启动子活性最高区域预测出的3个特异性蛋白1 (Sp1)转录因子结合位点分别进行点突变并构建3个突变载体,利用双荧光素酶检测系统测定其活性。结果显示,在构建的4个不同长度启动子缺失片段中1 656 (-1 604/+51)区域活性最高,在此区域构建的3个突变载体的启动子活性较野生型(片段1 656)均显著降低,说明-1 604/+51区域为北极狐CBD103基因的核心启动子区,-1 552/-1 564、-1 439/-1 454和-329/-339区域为正调控区域。文中成功获得了北极狐CBD103基因的核心启动子区域和正调控区域,这为进一步研究该基因调控北极狐被毛颜色分子遗传机制奠定了基础。     

PEPCK不同启动子调控报告基因表达效率的比较

目的构建两种不同的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因启动子调控报告基因表达质粒,比较该启动子在各种细胞系中的表达效率。方法采用PCR克隆大鼠PEPCK启动子1323 bp和560 bp两条片段,将两个PEPCK启动子片段插入pGL4.26-Luc2报告质粒中,将重组质粒转染到肝脏细胞系和脂肪细胞系,以非脂肪或肝脏细胞系做对照,比较PEPCK驱动荧光素酶表达效率。结果通过酶切鉴定及基因测序,证明pGL4.26-PEPCK-Luc2荧光素酶表达质粒构建成功,且能够在体外表达荧光素酶。结论两种同片段的PEPCK启动子在各细胞系中的表达效率差异无显著性。     

细胞内表达的小干扰RNA靶向丙肝病毒5′保守区的研究

将丙型肝炎病毒(HCV)基因组的5′非编码区(5′UTR)插入到报告基因绿色荧光蛋白(eGFP)和荧光素酶(luciferase)的上游,并构建基于Ⅲ型启动子的表达载体,这种载体能产生针对HCV 5′UTR的小干扰RNA.然后将含有HCV 5′UTR的eGFP/luciferase和能产生小干扰RNA的质粒共转染入Hela细胞,通过测定细胞发出的荧光和化学发光强弱来观测抑制效果.实验结果表明,与HCV 5′UTR特异性小干扰RNA表达质粒共转染的细胞无论从定性还是从定量上所测得的荧光和化学发光强度都明显低于阴性对照,且细胞密度经核染色与对照组无明显区别.这揭示了小干扰RNA确实能引起HCV特异基因如5′UTR的沉默,且转染进去的小干扰RNA表达质粒对细胞没有毒害作用.这一工作是通过载体直接在细胞内表达小干扰RNA(siRNA)而不是化学合成的,可以使小干扰RNA在细胞内得到稳定表达,因此本研究设计的siRNA表达载体不仅可以有效沉默HCV 5′UTR,而且该系统可以灵敏地筛选更有效的针对HCV的siRNA,因而这一结果为研究利用RNA干扰进行基因治疗HCV感染做了初步探索.     

小鼠pre-miRNA-122启动子荧光素酶报告质粒的构建及表达调控

[目的]构建小鼠pre-miRNA-122基因启动子荧光素酶报告质粒,研究血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)对miRNA-122表达的影响。[方法]利用生物信息学分析pre-miRNA-122启动子片段并扩增,插入pGL3-basic载体中获得报告质粒pmir-122-luc。将pmir-122-luc转染小鼠Huh-7和HepG2细胞,24h后检测荧光素酶活性;同样将其转染小鼠肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs),PDGF处理12h后检测活性。[结果]pre-miRNA-122上游5.5~4.5 kb为启动子区域。构建的质粒经酶切、测序鉴定正确。pmir-122-luc荧光素酶活性较pGL3-basic显著增加,且在Huh-7细胞高表达(24±5.02倍)而在HepG2细胞低表达(1.8±0.34倍)。pmir-122-luc能在HSCs中表达,且PDGF处理后活性降低(P0.05)。[结论]小鼠pre-miRNA-122启动子荧光素酶活性报告质粒构建成功;PDGF抑制miRNA-122在HSCs中表达,为探索miRNA-122的表达调控机制提供了新的窗口。