镰刀菌Q7-31T内切葡聚糖酶Egn21的分离纯化及酶学性质

【目的】为进一步研究镰刀菌Q7-31T产生的植物细胞壁降解酶的酶系信息。【方法】以1%(W/V)蛋白胨为氮源,0.5%(W/V)燕麦秸秆为碳源,20°C、120 r/min振荡培养3 d,诱导发酵培养菌株,获得的粗酶液经过Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE琼脂糖弱阴离子交换柱层析,最终得到纯化的内切葡聚糖酶,并对其进行酶学性质分析及串联质谱鉴定。【结果】研究表明:Egn21的分子质量为44.25 kDa,等电点为4.91;酶学特性研究显示:Egn21降解羧甲基纤维素的最适反应温度为40°C,在45°C以下比较稳定。该酶最适pH为6.0,在pH为5.0–8.0条件之间比较稳定。Co~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)对其没有明显作用,而Fe~(2+)、Ca~(2+)、K~(+)、Na~(+)和Mn~(2+)对酶活性有抑制作用,Hg~(2+)会使酶失去活性。【结论】从Q7-31T中分离纯化得到的内切葡聚糖酶Egn21,经过酶学特性与串联质谱鉴定结果显示其属于GH5家族。     

镰刀菌Q7-31T金属蛋白酶FQME14的分离纯化及鉴定

从镰刀菌Q7-31T燕麦秸秆诱导发酵的粗酶液中分离、纯化并鉴定金属蛋白酶。研究该蛋白酶的酶学特性,丰富和完善金属蛋白酶的基础资料;探究其在纤维素酶系降解纤维素过程中发挥的作用,旨在丰富和完善纤维素酶系降解机制。以燕麦秸秆为碳源诱导发酵镰刀菌Q7-31T,并在发酵第6天收酶。通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤层析和DEAE弱阴离子交换层析对粗酶液进行分离纯化得到金属蛋白酶,随后对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定。结果显示,从镰刀菌Q7-31T菌株的粗酶液中分离得到一种蛋白酶FQME14,其相对分子质量为30 k D;串联质谱鉴定的结果表明FQME14属于M14家族;蛋白酶酶学性质研究表明:该蛋白酶的比酶活为2.85 U/mg,最适反应p H和温度分别为p H 7.0和40℃,在p H 5.0-p H 9.0的范围内具有很好的稳定性,蛋白酶在50℃以下稳定性很好,超过50℃酶活力降低。该蛋白酶对酪蛋白、卵清蛋白和牛血清白蛋白都有很高的降解能力。金属离子Mn~(2+)和Co~(2+)对酶活性有激活作用,Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、K~+、Ca~(2+)和Na~+对酶活性有不同程度的抑制作用。从镰刀菌Q7-31T粗酶液中分离纯化得到蛋白酶FQME14,并对其进行了酶学性质的研究和串联质谱鉴定,结果表明FQME14为M14家族蛋白酶,是一种新的金属蛋白酶。     

镰刀菌Q7-31T果胶酶PGL1的分离纯化、酶学性质鉴定及结构分析

从镰刀菌Q7-31T中分离纯化和鉴定果胶酶并进行生物信息学分析,旨在探究果胶酶降解植物细胞壁的作用,进一步完善镰刀菌属纤维素降解酶系信息。以0.8%蛋白胨为氮源,0.5%燕麦秸秆为碳源诱导发酵培养镰刀菌Q7-31T;采用Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE琼脂糖弱阴离子交换柱层析对粗酶液进行分离纯化得到果胶酶PGL1;对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定;最后通过生物信息学分析结构及预测功能。PGL1分子量为36.21 k D,等电点为8.13;PGL1最适反应温度为40℃,最适反应p H为8;在20℃到50℃和p H 8.0到10.0能保持较高稳定性;Na~+、K~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)和Fe~(2+)对PGL1有抑制作用,串联质谱鉴定表明该蛋白为一种新型PL-1家族果胶酶。PGL1的二级结构构成元件中无规则卷曲和延伸链比例较高,分别占37.96%和31.17%;PGL1两端亲水性强而中间部分疏水性强;磷酸化位点共13个(Ser∶9;Thr∶3;Tyr∶1);PGL1存在2个潜在的N-糖基化位点;跨膜结构域预测显示其为分泌酶;功能结构域预测出其降解植物细胞壁的作用。从镰刀菌Q7-31T中分离纯化得到一种新型PL-1家族果胶酶PGL1并对其进行了生物信息学分析。     

斜卧青霉L-06内切葡聚糖酶Ⅰ基因的克隆与表达

【目的】克隆斜卧青霉L-06的内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egI),并实现其在大肠杆菌内的高效表达。【方法】利用RT-PCR技术克隆了斜卧青霉L-06的内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egI),并将egI基因克隆到原核表达载体中,构建了重组质粒pET32a-egI。【结果】转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测结果表明:重组表达产物的相对分子质量约为80 kD,与预期相符。重组表达的菌悬液,经破碎离心,取其上清液,进行纤维素酶活性染色,获得了活性条带。DNS法测得内切酶活力为2.56 IU/mL。【结论】构建了斜卧青霉L-06内切葡聚糖酶Ⅰ的原核表达系统。     

一株产琼胶酶细菌的分离、鉴定及其琼胶酶基本性质

【目的】分离海洋来源的琼胶酶产生菌,对其进行分类鉴定,并研究其所产琼胶酶的基本酶学性质,为琼胶酶的应用研究及开发利用奠定基础。【方法】通过以琼脂为唯一碳源的选择培养基分离产琼胶酶的菌株;利用16S rRNA基因序列分析、表型和生理生化特征对菌株进行鉴定;通过DNS-还原糖法测定琼胶酶活性;利用显色底物法测定琼胶酶的类型;对菌株所产琼胶酶粗酶的酶学性质进行初步研究。【结果】分离到一株产琼胶酶的菌株NTa,16S rRNA基因序列分析显示该菌株属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.);该菌株主要产胞外琼胶酶,可分泌α-琼胶酶和β-琼胶酶;琼胶酶粗酶的最适反应温度和pH分别为40℃和7.0,并且琼胶酶在温度低于30℃,pH为7.0-9.0时稳定;Ca2+对琼胶酶粗酶具有促进作用,Ag+、Fe2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和Fe3+均可不同程度地抑制酶的活性;EDTA对琼胶酶粗酶活性具有抑制作用;琼胶酶粗酶对检测的抑制剂、去垢剂及变性剂有较好的抗性。【结论】海洋细菌Stenotrophomonas sp.NTa是一种新型的产琼胶酶菌株,可同时分泌α-琼胶酶和β-琼胶酶,具有潜在开发利用价值。     

链霉菌IMS002的分类鉴定及其抗真菌活性物质解析

【目的】对一株分离自植物根际土壤的具有抗真菌活性的链霉菌IMS002进行菌株分类鉴定,通过活性追踪分离纯化并鉴定有机相中的活性物质。【方法】通过16S rDNA和5个不同基因(atpD,gyrB,recA,rpoB,trpB)串联聚类分析以及生理生化实验分析,对链霉菌IMS002进行菌株分类鉴定,用扫描电子显微镜观察该株链霉菌的菌丝及孢子形态,以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌进行生物活性追踪,通过硅胶柱层析、凝胶柱层析及高压液相色谱(HPLC)对活性物质进行分离和纯化,使用液质联用高分辨质谱仪、500 MHz核磁共振波谱仪以及圆二色光谱仪确定该物质的化学结构。【结果】IMS002经初步鉴定与产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)具有较近的亲缘关系,其发酵液对尖孢镰刀菌具有良好的抑菌效果,经分离和纯化以及现代波谱技术分析,确定有机相中的抑菌活性组分为Borrelidin。【结论】链霉菌IMS002能够产生化合物Borrelidin,该化合物对尖孢镰刀菌具有抑制活性。     

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var. levisporus内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性研究

采用培养分离、室内测定等方法,对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var. levisporus产生的内切β-葡聚糖酶进行了分离纯化及特性研究.粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的内切β-葡聚糖酶.结果表明,经12% SDS-PAGE测得酶的单亚基分子量约为31.5 kD,凝胶过滤层析测得酶的分子量约为34.5 kD.该酶反应的最适温度为55 ℃,最适pＨ为2.5～3.0该酶在pH3.0条件下60 ℃较为稳定;80 ℃保温30 min有20%原酶活性.金属离子对内切β-葡聚糖酶活性影响较大, 其中K⁺、 Ca²⁺、Mn²⁺对酶有激活作用;Al⁺、Cu²⁺ 、Al³⁺对酶有显著抑制作用.该酶对羧甲基纤维素具有很强的底物特异性.     

脂环酸芽孢杆菌D-1的耐盐内切葡聚糖酶基因克隆、表达与酶学性质北大核心CSCD

【目的】克隆温泉中嗜热嗜酸的脂环酸芽孢杆菌D-1(Alicyclobacillus tengchongensis CGMCC1504)的内切葡聚糖酶基因gluE1,并对该酶进行序列分析和重组酶的酶学特性分析。【方法】通过全基因组测序获得gluE1全长,并对其氨基酸序列(GluE1)进行分析。将gluE1重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,利用组氨酸标签纯化GluE1并进行酶学性质分析。【结果】gluE1与NCBI数据库中GH5的内切葡聚糖酶具有较高的相似性,全长1020 bp,GC含量50.5%,编码339个氨基酸(40.45 k Da)。GluE1与数据库中序列的最高一致性为97%,与其余纤维素酶的一致性<60%。GluE1可水解CMC-Na、可溶性淀粉和大麦β-葡聚糖,表观最适pH为6.5,pH 5.0–10.0稳定并维持60%以上的酶活性。GluE1的表观最适温度为55℃,在37℃下稳定。在55℃ pH 6.5条件下,GluE1对大麦β-葡聚糖的K_m、V_(max)和k_(cat)分别为8.58 mg/mL、416.67 U/mg和280.90 s^(–1)。GluE1受Ag^+、Hg^(2+)及SDS抑制,β-巯基乙醇、Pb^(2+)、Mg^(2+)、Ca^(2+)和Na^+对GluE1有微弱的促进作用,NaCl对GluE1的影响不大,加入30%的NaCl,仍有64%以上的酶活性;经30%的NaCl在37℃下处理60 min,仍能保持93%以上的活性。【结论】首次报道从Alicyclobacillus属的细菌中克隆得到内切葡聚糖酶基因并对其酶学性质进行研究,GluE1具有良好的pH稳定性和有较强的耐盐性,可能具有更大应用潜力。     

金属离子及保护剂对深绿木霉T155产芥子酶的活性影响及芥子酶的分离纯化

【目的】探求金属离子及保护剂对深绿木霉T155产生的粗芥子酶液活性的影响以及芥子酶的分离纯化方法。【方法】通过添加不同浓度的金属离子及保护剂研究对芥子酶活性的影响并通过细胞破壁、硫酸铵沉淀、透析、Sephadex G-100柱层析、DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-200柱层析等方法提取到纯的芥子酶,最后通过电泳检测芥子酶的纯度和分子量。【结果】研究发现Ag+、Zn2+、Pb2+、Mg2+、Hg2+、Fe3+等金属离子在低浓度时对芥子酶均表现为一定的促进作用,但达到一定浓度后则起抑制作用,Ca2+浓度在0.069–17.000 g/L范围内均对酶活性起到促进作用,且促进效果基本与Ca2+浓度成正比;添加1 mmol/L EDTA和3 mmol/L DTT对芥子酶的保护作用最好,4°C保存26 d后芥子酶能够保持85%活性;电泳分析该芥子酶的分子量大约在150 kD左右,并且是一个二聚体。【结论】Ca2+在实验浓度内主要是提高芥子酶活性,而其他金属离子对芥子酶活性主要起抑制作用;EDTA或者EDTA与DTT协同能够较好保持芥子酶活性的稳定性;通过一系列分离纯化步骤得到了纯的二聚体芥子酶,研究结果为挖掘产芥子酶的微生物资源提供了新的途径和思路。     

低温葡聚糖内切酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质

自黄海长海县附近海泥中分离得到一株产低温葡聚糖内切酶的菌株SWD-28, 经形态学及ITS 序列鉴定为Penicillium cordubense。对该菌株产的粗酶液进行硫酸铵盐析和Sephadex G100柱层析, 比活力达到26.4 U/mg, 提高20.6 倍, 回收率13.1%。得到一个电泳纯的低温葡聚糖内切酶, 分子量为33.1 kD。经圆二色对其结构进行检测, 发现其α-螺旋占49.9%, β-折叠占0.0%, 转角占24.3%, 随机卷曲占25.8%, 呈典型α 螺旋。对其酶学性质进行初步研究, 结果表明其最适pH为5.0, 最适反应温度为35 °C, 在5 °C 酶活力仍能保持60%。     

微囊藻毒素降解菌的筛选、鉴定及其胞内粗酶液对藻毒素MCLR的降解

【目的】从巢湖底泥中分离筛选高效的藻毒素降解菌,并初步研究其胞内粗酶液降解藻毒素-LR(MC-LR)的特性,为水体中藻毒素污染的微生物治理提供有效的菌源与理论依据。【方法】利用富集驯化培养技术,以MC-LR为唯一碳源,分离筛选MC-LR降解菌,通过形态观察、生理生化实验及16S rRNA序列分析鉴定菌株,并考察其胞内粗酶液在不同条件下对MC-LR的降解特性。【结果】分离得到1株能高效降解MC-LR的菌株M6。分子鉴定结果表明,该菌株为蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)。其降解MC-LR的活性物质为胞内酶,而且至少有3种酶参与了MC-LR的降解,它们是菌体本身的组织酶而非诱导酶。当反应体系pH值为8.0,胞内粗酶液浓度为404.9 mg/L,MC-LR的初始浓度为10 mg/L时降解率最高,16 h可达98.7%。【结论】分离出的MC-LR降解菌为蜡状芽胞杆菌,该菌株对MC-LR有较高的降解能力,并且酶促反应受到反应体系的pH值、胞内粗酶液浓度以及藻毒素初始浓度等因素的影响。     

沙质微泡菌β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质

【背景】β-葡聚糖是自然界中广泛存在的非淀粉多糖,是谷类植物细胞壁的主要成分。β-葡聚糖酶能够水解β-葡聚糖生成低聚合度的寡糖,在食品、饲料、造纸等领域发挥着重要的作用。【目的】从海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)中克隆到一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,在大肠杆菌中可溶表达,研究其相关酶学性质。【方法】以沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)基因组DNA为模板,克隆一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(MaGlu16A),构建重组表达载体p ET-28a-MaGlu16A并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行酶学性质研究。【结果】MaGlu16A的最适pH和最适温度分别为pH 6.0和40°C,在pH 5.0-10.5和35°C以下稳定。对EDTA具有较高的抵抗性,在1 mmol/L和10 mmol/L EDTA浓度下仍保持99.3%和82.5%的酶活力。该酶能够有效水解可得然多糖、昆布多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖、燕麦葡聚糖和酵母葡聚糖,水解产物主要为葡萄糖、二糖、三糖和四糖。【结论】海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbiferarenaceous)来源β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质的测定为β-葡聚糖酶的挖掘及β-葡寡糖的制备奠定了基础。     

产木质纤维素降解酶真菌的筛选及产酶特性

【背景】利用微生物处理秸秆引起研究者的广泛关注。【目的】筛选生长速度快、木质纤维素降解酶活性强的真菌菌株,用于植物秸秆降解和高效利用。【方法】从自然界采集的样品中分离纯化真菌菌株,利用PDA-愈创木酚和PDA-羧甲基纤维素钠平板初筛,再经过液体发酵检测漆酶酶活、羧甲基纤维素酶酶活及菌丝生长速率复筛目的菌株,通过内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)测序法对目的菌株进行鉴定,对目的菌株产漆酶和羧甲基纤维素酶活力进行测定及酶学性质研究。【结果】从样品中分离纯化到18株真菌,通过初筛筛选出9株产木质纤维素降解酶真菌菌株,再经过复筛,筛选出一株产漆酶、羧甲基纤维素酶活力高、菌丝生长快的菌株M1,经过分子生物学鉴定M1为糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus),其漆酶酶活为(243.59±1.11)U/mL,羧甲基纤维素酶酶活为(36.03±0.63) U/mL。在5 d的培养期内,菌丝生长速率为(9.43±0.32) mm/d。对菌株M1的发酵粗酶液的酶学性质进行了检测分析,结果表明,所产的漆酶在pH5.0-6.5相对酶活为90%以上,在pH ...     

一株产卡拉胶酶细菌的分离鉴定及其酶学性质

【目的】从红树林土壤腐叶中分离出能够产生卡拉胶酶的菌株,对其进行鉴定,并研究其酶学性质。【方法】利用以卡拉胶为唯一碳源的培养基,分离出产卡拉胶酶的菌株;通过形态学观察、16S r DNA序列分析对其进行种属鉴定;对该菌株所产卡拉胶酶进行纯化并采用DNS测酶活的方法测定酶学性质。【结果】从红树林土壤腐叶中分离出1株高产κ-卡拉胶酶的菌株ASY5,经鉴定该菌株为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.ASY5)。纯化得到的κ-卡拉胶酶的分子量约为30 k Da;酶学性质试验表明,其最适反应温度和p H分别为60℃和7.5,在50℃以下酶的稳定性较好,在p H 7.0-9.0范围内酶活力较稳定,对κ-卡拉胶具有良好的底物特异性,以κ-卡拉胶为底物时Km值和Vmax值分别为2.28 mg/m L和147.06μmol/(min·mg),Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Al3+等对酶活有显著的促进作用,而Ag+、Zn2+、Cd2+及SDS对酶活有强烈的抑制作用。【结论】分离到的细菌假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.ASY5产生的κ-卡拉胶酶在较高的温度和碱性条件下均具有较高的酶活性,为利用卡拉胶水解酶产生卡拉寡糖的研究和应用奠定了基础。     

火球菌Pyrococcus furious瓣状核酸内切酶1的表达纯化及酶学特征

【目的】克隆表达和纯化火球菌Pyrococcus furious来源的瓣状核酸内切酶1基因pFEN1(PF1414),对该蛋白的活性和酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将pFEN1在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的荧光标记的寡核苷酸片段作为底物,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定pFEN1在体外的酶学特性以及与其他蛋白的相互作用。【结果】pFEN1重组蛋白能在大肠杆菌中进行高效表达;高于100 mmol/L的NaCl会抑制pFEN1的活性;pFEN1的核酸酶活性依赖于金属离子Mg~(2+)或Mn~(2+),且Mn~(2+)的催化效率优于Mg~(2+);来自嗜热古菌的pFEN1是一种耐高温蛋白,最适反应温度为60–65°C;增殖细胞核抗原(PCNA)能促进pFEN1的内切酶活性。【结论】本研究证实pFEN1是一种Mg~(2+)或Mn~(2+)依赖的核酸内切酶,且PCNA能促进该酶的活性。     

一株产低温β-半乳糖苷酶微杆菌的筛选鉴定、产酶条件及其酶学特性

【背景】低温β-半乳糖苷酶能在低温下仍保持较高的乳糖水解活性,筛选酶学特性适合在牛乳体系中高效水解乳糖的β-半乳糖苷酶生产菌株,是低乳糖牛乳加工产业关注的焦点。【目的】对天山中国一号冰川沉积物中分离的一株产低温β-半乳糖苷酶菌株的产酶条件和酶学特性进行研究。【方法】结合X-Gal平板法初筛和测定粗酶液酶活复筛,获得产低温β-半乳糖苷酶的菌株。通过形态学、生理生化试验及16S rRNA基因测序分析对筛选菌株进行鉴定,单因素摇瓶实验优化菌株的产酶条件,硫酸铵分级沉淀初步纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行分析。【结果】通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因鉴定,确定菌株LW106为微杆菌属(Microbacterium)菌株;该菌株最适产酶温度为25°C,最佳产酶碳源为可溶性淀粉,培养基初始pH为7.0,接种量为3%;对初步纯化的低温β-半乳糖苷酶酶学性质的研究表明,LW106所产β-半乳糖苷酶的最适pH为6.0,最适反应温度为35°C,4°C时酶活为最大酶活的78%,4°C和pH 7.0时的稳定性最好,10 mmol/L的Na+对酶活性基本没有抑制作用,Ca~(2+)对酶活性具有一定的激活作用。【结论】菌株LW106所产低温β-半乳糖苷酶的酶学特性表明该酶在乳品低温加工领域具有进一步研究和应用的价值。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)产生的内切β葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sepharose Fast Flow阴离子层析、Pheny1\|Sepharose疏水层析、Sephacry1 S\|100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切β\|葡聚糖酶。经125%SDS\|PAGE和凝胶过滤层析法分别测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为67.8kD和69.8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为60℃和40～45在pH50条件下,该酶在60℃下稳定;70℃保温1h后,仍保留30%的活性;在80℃的半衰期为25min。金属离子对内切β\|葡聚糖酶的活性影响较大,其中Na+对酶有激活作用;Fe2+、Ag+、Cu2+、Ba2+、Zn2+等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素没有水解能力。     

水貂源高产蛋白酶枯草芽孢杆菌的分离筛选及酶学性质

【背景】开发、筛选优良益生菌菌种是当下畜牧业的研究热点,益生菌的潜在功能也被广为挖掘。【目的】分离、筛选具有良好耐受性且高产胞外蛋白酶的菌株,研究其生物学特性和酶学性质,为后续微生物蛋白酶的制备和微生态制剂的开发提供菌种资源。【方法】采集健康水貂新鲜粪便,配制酪蛋白培养基初筛和优化Folin-酚法复筛,对筛选菌进行生物学特性研究,获得产蛋白酶能力较强、耐受性较优的菌株,并进行常规鉴定和分子生物学鉴定,最后对蛋白酶酶学性质进行研究。【结果】筛选得到一株高产蛋白酶、耐受性较优的芽孢杆菌,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),编号为3。在初始发酵培养基条件下,酶学性质研究结果表明,该蛋白酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH值为9.0,最佳金属离子激活剂为K+,Cu2+和Fe2+对酶活力有明显的抑制作用,在20%浓度的有机溶剂作用时蛋白酶未变性失活。【结论】从水貂粪便中分离获得一株具有良好的生物学特性、酶学性质和碱性蛋白酶活性的枯草芽孢杆菌,为该菌株在实际生产应用中提供了基础保障。     

大熊猫肠道纤维素分解菌的分离鉴定及产酶性质

【目的】从健康大熊猫新鲜粪便中分离具有纤维素酶活性的菌株,并对其进行菌种鉴定及产酶性质研究。【方法】利用羧甲基纤维素钠培养基分离纯化具有较高纤维素酶活性的菌株,根据形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA分析对其进行分类鉴定,研究影响该菌株纤维素酶的产酶条件,以及对不同纤维素底物的降解情况。【结果】分离得到一株纤维素酶产生菌株P2,该菌株为好氧的革兰氏阳性细菌,生长温度范围20-50℃(最适温度37℃),pH范围6.0-9.0(最适pH7.0),NaCl浓度范围0%-15%(最适2%NaCl),培养24h达到产酶高峰。16S rDNA基因序列分析显示,菌株P2与解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NBRC15535相似性为99.66%。该菌株对四种纤维素底物(滤纸、脱脂棉、秸秆、竹纤维)均有不同程度的降解,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和总酶活具有不同的酶活变化。【结论】本研究首次从大熊猫粪便中分离出了好氧纤维素分解菌,并鉴定为解淀粉芽胞杆菌,对上述四种纤维结构均有一定的破坏和分解作用,为进一步研究大熊猫竹纤维消化机制提供了菌源。