镰刀菌Q7-31T内切葡聚糖酶Egn20的分离纯化鉴定及酶学特性

摘要:【目的】从镰刀菌Q7-31T燕麦秸秆诱导发酵的粗酶液中分离、纯化并鉴定内切葡聚糖酶,研究其酶学特性。为丰富和完善镰刀菌的酶系信息提供理论支持。【方法】以燕麦秸秆为碳源诱导发酵培养菌株,采用Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE琼脂糖弱阴离子交换柱层析对粗酶液进行分离纯化得到内切葡聚糖酶Egn20,随后对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定。【结果】分离纯化得到内切葡聚糖酶Egn20,其分子量为55.37 kDa,等电点为7.44;酶学特性结果表明:Egn20对羧甲基纤维素的最适反应温度为40 ℃,最适pH为6.0,该酶在45 ℃和弱酸性环境下较稳定,Fe2+对其有激活作用,Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和K+抑制该酶活性,Hg2+使该酶失活;酶学特性和串联质谱鉴定的结果表明Egn20属于GH7家族。【结论】从镰刀菌Q7-31T粗酶液中分离纯化得到内切葡聚糖酶Egn20,并对其进行了酶学性质的研究和串联质谱鉴定,结果表明Egn20为GH7家族内切葡聚糖酶。本研究为丰富和完善镰刀菌的酶系信息提供了理论和数据支持。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

南极菌产琼胶酶aga3311的表达、性质及其降解特性

【目的】本文通过对具有琼胶降解能力的南极菌Pseudoalteromonas sp.NJ21全基因组进行生物信息学分析,筛选获得琼胶酶疑似序列aga3311,采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行了验证和分析。【方法】首先对aga3311进行克隆和表达;采用Ni-NTA对重组酶进行纯化;DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质;用薄层层析(TLC)和质谱(MS)技术对Aga3311的酶解产物进行分析。【结果】构建的重组表达质粒p ET-30(a)+aga3311能够在工程菌E.coli BL21(DE3)中实现高效表达,其中可溶性表达为30%左右;纯化的重组酶Aga3311分子量为87 k Da,其最适作用温度为35°C,30–45°C的范围内稳定性较高,50°C则迅速失活,具有热不稳定的特征;最适p H为7.0,在p H 4.0–10.0的范围内仍能保持50%以上的活性;金属离子Fe~(3+)、Be~(2+)、Zn~(2+)和Ca~(2+)均能显著提高Aga3311的活性,特别是Ca~(2+)使其酶活提高1倍。该酶的酶解终产物经TLC和质谱分析主要为新琼二糖。【结论】重组酶Aga3311为Glyco_hydro_42家族的外切型β-琼胶酶,能够特异性降解琼脂糖生成新琼二糖。     

特异腐质霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

【目的】在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究。【方法】利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ)的cDNA。将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115。【结果】SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达。重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70°C,且在65°C以下具有较好的热稳定性。最适反应pH为6.5,在pH 6.0?7.0之间有较好的稳定性。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础。     

双功能域β-折叠桶碱性植酸酶蛋白序列分析与酶学特性

【目的】表达、纯化来源于Bacillus sp.HJB17的双功能域β-折叠桶碱性植酸酶(phy HT),并对该酶进行蛋白序列以及酶学特征分析,为该酶的广泛应用奠定基础。【方法】应用生物信息学技术,对phy HT蛋白序列进行了生物信息学分析。表达、变复性、分离纯化得到具有酶活性的可溶性phy HT蛋白溶液,通过硫酸亚铁-钼蓝法对phy HT的酶学特性进行了研究。【结果】序列分析结果显示,phy HT由633个氨基酸组成,含有2个植酸酶结构域,属于典型的BPP植酸酶,相对分子量(MW)为69321.68 Da,理论等电点为5.37,为亲水性蛋白。二级结构中,phy HT中α-螺旋(helix)、β-片层(sheet)占主要的比例,高级结构以β片层形成的桶状结构为主。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为35°C,在45°C以下比较稳定。最适的p H为8.0,在p H为6.0–12.0条件之间比较稳定。低浓度的Ca~(2+)以及Mg~(2+)对酶活性有促进作用,Fe~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)等金属离子对酶活性有抑制作用。【结论】本研究成功对phy HT进行了蛋白序列分析以及酶学性质研究,phy HT属于碱性植酸酶,酶活性高、稳定性好,在理论研究和工业生产方面均有很大应用价值。     

蠼螋肠道中碱性内切葡聚糖酶基因的克隆表达及功能分析

【目的】从蠼螋肠道细菌菌株Q5中获得一个新型耐碱纤维素酶基因,通过异源表达、酶学性质及功能分析,旨在为以后进一步研究开发高温碱性纤维素酶提供一些理论参考。【方法】采用刚果红平板初筛法,从河南南阳宝天曼国家级自然保护区落叶堆下的昆虫蠼螋肠道中,获得具有分泌较高活性碱性纤维素酶的细菌菌株。基于该菌株的形态学、生理学及16S rRNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定。并通过设计简并引物,从高活性菌株中克隆出该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析,并导入大肠杆菌BL21中表达。【结果】获得1株具有分泌较高活性碱性内切葡聚糖酶的细菌菌株Q5,经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,进一步从Q5菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1500 bp的内切葡聚糖酶基因(GenBank KR067575),在NCBI比对后发现该基因的氨基酸序列与芽孢杆菌菌株LM 4-2的耐碱性β-1,4-内切葡聚糖酶基因(AKE23721.1)有98%的同源性。重组菌经优化培养,细胞破碎后上清液中的酶活力可达3.46 U/mL,是出发菌株Q5(2.05 U/mL)的1.69倍。经正交实验优化后的酶活力为4.99 U/mL。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度与pH值分别为50°C与pH 8.5,在pH 8.0和9.0保温48 h,其酶活力仍然维持到最高酶活的82%和81%;该酶在50°C以下较稳定,60°C以上酶活迅速降低。10 mmol/L的Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶的活性有明显促进作用,重组酶Ega5的K_m和V_(max)分别是2.217 mol/mL和9.606μmol/(min·L)。该重组酶对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有显著抑制作用。【结论】本文首次从蠼螋肠道中筛选到了一株产碱性内切葡聚糖酶的细菌菌株并从中克隆出了一个碱性纤维素酶基因,为该酶在碱性条件的应用奠定了理论基础。     

一株产低温β-半乳糖苷酶微杆菌的筛选鉴定、产酶条件及其酶学特性

【背景】低温β-半乳糖苷酶能在低温下仍保持较高的乳糖水解活性,筛选酶学特性适合在牛乳体系中高效水解乳糖的β-半乳糖苷酶生产菌株,是低乳糖牛乳加工产业关注的焦点。【目的】对天山中国一号冰川沉积物中分离的一株产低温β-半乳糖苷酶菌株的产酶条件和酶学特性进行研究。【方法】结合X-Gal平板法初筛和测定粗酶液酶活复筛,获得产低温β-半乳糖苷酶的菌株。通过形态学、生理生化试验及16S rRNA基因测序分析对筛选菌株进行鉴定,单因素摇瓶实验优化菌株的产酶条件,硫酸铵分级沉淀初步纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行分析。【结果】通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因鉴定,确定菌株LW106为微杆菌属(Microbacterium)菌株;该菌株最适产酶温度为25°C,最佳产酶碳源为可溶性淀粉,培养基初始pH为7.0,接种量为3%;对初步纯化的低温β-半乳糖苷酶酶学性质的研究表明,LW106所产β-半乳糖苷酶的最适pH为6.0,最适反应温度为35°C,4°C时酶活为最大酶活的78%,4°C和pH 7.0时的稳定性最好,10 mmol/L的Na+对酶活性基本没有抑制作用,Ca~(2+)对酶活性具有一定的激活作用。【结论】菌株LW106所产低温β-半乳糖苷酶的酶学特性表明该酶在乳品低温加工领域具有进一步研究和应用的价值。     

火球菌Pyrococcus furious瓣状核酸内切酶1的表达纯化及酶学特征

【目的】克隆表达和纯化火球菌Pyrococcus furious来源的瓣状核酸内切酶1基因pFEN1(PF1414),对该蛋白的活性和酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将pFEN1在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的荧光标记的寡核苷酸片段作为底物,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定pFEN1在体外的酶学特性以及与其他蛋白的相互作用。【结果】pFEN1重组蛋白能在大肠杆菌中进行高效表达;高于100 mmol/L的NaCl会抑制pFEN1的活性;pFEN1的核酸酶活性依赖于金属离子Mg~(2+)或Mn~(2+),且Mn~(2+)的催化效率优于Mg~(2+);来自嗜热古菌的pFEN1是一种耐高温蛋白,最适反应温度为60–65°C;增殖细胞核抗原(PCNA)能促进pFEN1的内切酶活性。【结论】本研究证实pFEN1是一种Mg~(2+)或Mn~(2+)依赖的核酸内切酶,且PCNA能促进该酶的活性。     

蜡样芽胞杆菌磷脂酶C在乳酸克鲁维酵母中重组表达、纯化及酶学性质分析

【目的】构建蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)的重组乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。【方法】以B.cereus基因组DNA为模板,PCR扩增得到磷脂酶C基因(bcplc),构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒并转化到乳酸克鲁维酵母中,实现bcplc基因的表达。利用镍柱亲和层析纯化和脱盐柱得到电泳纯的重组磷脂酶C(rbcPLC)。【结果】成功构建产磷脂酶C的重组乳酸克鲁维酵母并纯化了重组磷脂酶C,纯化后rbcPLC经SDS-PAGE分析在40 kDa附近出现显性条带。NPPC法测得rbcPLC酶活为19251 U/mg,最适反应温度为80°C,最适pH为9.0。在低于40°C时,pH 7.0-8.0时,rbcPLC重组酶较稳定。Cu~(2+)和Co~(2+)对其有明显的抑制作用;Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的促进作用。【结论】首次实现了对蜡样芽胞杆菌来源的磷脂酶C在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化及其酶学性质分析,为其它食品安全性微生物来源的磷脂酶C的研究提供了借鉴意义。     

土壤中高产蛋白酶菌株产酶条件及酶学性质

【背景】微生物蛋白酶已经成为工业用蛋白酶的主要来源,筛选具有特殊环境适应性的微生物成为生物酶资源的开发热点。【目的】通过对青藏高原土壤微生物产蛋白酶菌株的筛选、优化及相关特性研究,寻找新的蛋白酶资源,为高原菌种资源利用提供科学依据。【方法】采用形态学和分子生物学对筛选菌株进行菌种鉴定,利用单因素试验和正交试验对菌株进行发酵条件优化及酶学性质的探究。【结果】筛选出一株高产蛋白酶菌株XC2,经鉴定菌株XC2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。XC2最优产酶条件:可溶性淀粉4.0%,牛肉膏1.0%,K~+0.6%,培养温度34°C、初始pH 7.0、接种量2.0%的条件下200 r/min振荡培养13 h,所产蛋白酶活力最高为638.5 U/mL。XC2所产蛋白酶最适反应温度60°C,最适pH9.0;40-50°C、pH8.0-10.0条件下酶活稳定性较高;Mn~(2+)对酶活力有明显激活作用,而Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Fe3+对酶活力有明显抑制作用。【结论】枯草芽孢杆菌XC2有较强的产碱性蛋白酶的能力,具有较好的应用前景。     

地衣芽孢杆菌TG116胞外蛋白酶产酶条件与酶学性质

【背景】从独角莲中分离得到的地衣芽孢杆菌TG116是一株对植物病原菌具有广谱抗性作用的生防菌株。【目的】优化TG116的产酶条件并探索其酶学性质,进一步了解其抗菌机制。【方法】采用Folin-Phenol显色法与响应曲面法,优化菌株TG116的产酶条件并研究其蛋白酶的酶学性质。【结果】菌株TG116产酶最适条件为:温度40.83°C,p H 8.01,发酵时间53.74 h,增加通气量可以显著提高酶活力。按照优化后的条件培养48 h后,上清液蛋白酶活力从57.46 U/mL达到了254.07 U/mL。酶学性质研究表明:该酶为碱性蛋白酶,最适反应pH为8.5,最适反应温度为50°C,具有良好的温度和pH稳定性,EDTA对酶活具有强烈的抑制作用,金属离子Mg~(2+)、Ca~(2+)、Na~+、Co~(2+)、K~+等对酶活也具有一定的抑制作用。【结论】菌株TG116具有良好的p H与温度稳定性,在实际应用中蛋白酶不易失活,可以分解真菌的细胞壁蛋白成分,破坏细胞壁结构,从而抑制甚至杀死病原菌,达到抗菌作用。     

鸡源和猪源乳杆菌胆盐水解酶的表达及酶学性质比较

【目的】随着抗生素生长促进剂(AGPs)在动物饲料中逐步禁止使用,AGPs替代物的研究成为热点。由于胆盐水解酶(BSH)在脂类代谢中的关键作用,成为AGPs替代物研究的一个重要方向。在原核表达和纯化的基础上鉴定鸡源和猪源乳杆菌BSH在酶学性质方面的差异性。【方法】分别对鸡源胆盐水解酶(BSHc)和猪源胆盐水解酶(BSHp)基因进行原核表达和蛋白纯化,通过测定对6种甘氨结合胆盐和牛磺结合胆盐的水解效率获得两种酶的酶学动力学性质,进而测定了温度、pH和金属离子对酶活力的影响。【结果】BSHc和BSHp对甘氨结合胆盐的水解效率高于牛磺结合胆盐,BSHc对甘氨结合胆盐的水解效率较BSHp稍高;BSHc和BSHp的最适酶解温度分别为45°C和42°C;BSHc和BSHp的最适反应pH分别为6.0和5.4;含有Cu~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)和Zn~(2+)的金属盐对BSHc和BSHp的酶活力均具有不同程度的抑制作用,特别是Cu~(2+)和Fe~(3+)抑制作用比较强;含有Na~+、K~+、Mg~(2+)和Ca2+的金属盐对BSHc和BSHp酶活力的抑制作用相对较弱或无抑制作用,但KIO3对BSHc和BSHp酶活力具有强抑制作用,KI和CaCl_2对BSHp酶活力也具有较强的抑制作用。【结论】原核表达和纯化的BSHc和BSHp对甘氨结合胆盐的水解效率高于牛磺结合胆盐,BSHc的最适酶解温度和pH稍高于BSHp,Cu~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)和Zn~(2+)等金属离子对BSHc和BSHp酶活力具有明显抑制作用,试验结果为鉴定BSH抑制物进而研制AGPs替代物奠定了基础。     

鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造

【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。     

链霉菌来源D-甘露糖异构酶的性质及其在制备D-甘露糖中的应用

【背景】D-甘露糖具有多种功能活性,在食品、医药、饲料等行业应用广泛。D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化,在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力。【目的】克隆一个链霉菌(Streptomycessp.)来源的D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA)并在大肠杆菌中表达,研究其酶学性质,并用于制备D-甘露糖。【方法】从链霉菌(Streptomycessp.)中发掘一个D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA),构建重组表达质粒pET-28a-ssMIaseA并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后测定酶学性质,利用高效液相色谱对SsMIaseA制备D-甘露糖进行研究。【结果】SsMIaseA与嗜热裂孢菌(Thermobifda fusca)来源的D-甘露糖异构酶ManI相似性最高,为60.2%。该酶比酶活为525 U/mg,分子量约为45 kD,最适pH和温度分别为7.5和45°C,在pH 6.5-10.0范围内和45°C以下保持稳定。该酶对甘露糖具有最高催化活性,其次是果糖、塔罗糖和塔格糖。利用SsMIaseA转化600 g/L D-果糖,反应8 h达到平衡,生成185 g/L D-甘露糖,转化率为31%。【结论】SsMIaseA作为新型D-甘露糖异构酶为D-甘露糖的酶法制备奠定了基础。     

酿脓链球菌Cas9核酸酶的重组表达、分离纯化及酶学特性

【背景】Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶,可与单链向导RNA (single-guide RNA,sgRNA)形成稳定的核糖核蛋白复合物,识别和切割特定的核苷酸片段。由于其具备高灵活性和高效率的特点,目前已经成为基础科学研究领域和临床治疗方法中使用最广泛的基因编辑工具。【目的】为Cas9核酸酶的合理开发和利用提供理论依据。【方法】利用大肠杆菌表达系统表达野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9核酸酶,经硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析两步纯化获得较高纯度表达产物,并对其热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响等酶学特性进行研究。【结果】经高密度发酵后,大肠杆菌湿菌重达191.0 g/L。纯化后酿脓链球菌Cas9核酸酶的比酶活达641.29 U/mg,纯化倍数为16.02,收率为46.40%。Cas9核酸酶在25-42°C保温2 h后剩余酶活保持在65%以上,而在45°C保温15 min后全部失活;其在pH 6.0-10.0范围内稳定性较高,剩余酶活大于68%,在pH9.0时稳定性最高;0.5-20.0mmol/L浓度范围内的Mg~(2+)对该酶有激活作用,10.0 mmol/L的Mg~(2+)可使该酶酶活力提高约23%;Ba~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)对该酶有不同程度的抑制作用,其中0.5 mmol/L的Cu~(2+)和Fe~(2+)对Cas9核酸酶有完全抑制作用。【结论】异源表达并纯化出具有较高纯度和较高酶活力的酿脓链球菌Cas9核酸酶,并对其酶学特性进行了初步研究,该结果对CRISPR/Cas9技术的进一步推广和应用有一定的指导意义。     

破囊壶菌脂肪酶基因的克隆、双温控自诱导表达及酶学性质研究

【目的】克隆破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源高效表达,并进行初步酶学性质研究。【方法】基于转录组数据注释,获得脂肪酶基因lip,构建重组基因工程菌Rosetta(DE3)/p ET30-lip,利用双温控自诱导方法高效表达蛋白,表达产物(LIP)经Ni-Agarose His亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从Aurantiochytrium sp.PKU#SW7中克隆得到一个大小为873 bp的脂肪酶基因(Gen Bank登录号为KT305964),该酶对p-NPB最适反应温度和pH分别为40°C和8.0。以不同浓度的金属离子Ca~(2+)和Co~(2+)溶液分别保温处理酶液30 min可使酶活提高1.3倍左右;甲醇对脂肪酶的抑制作用不明显。在最适反应条件下对p-NPP与p-NPB的酶活力分别为70.0±3.1 U/mg和102.5±2.6 U/mg。【结论】Aurantiochytrium sp.PKU#SW7脂肪酶具有良好的特性,符合生物柴油生物催化剂基本要求。     

高选择性不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺的重组氧化还原酶催化性质及其酶促转化

【目的】通过表达多种重组立体选择性氧化还原酶,分析其催化不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的性质,从而构建酶促合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)的反应体系。【方法】基于已有立体选择性氧化还原酶重组大肠杆菌,通过Ni离子亲和层析法纯化得到重组氧化还原酶,以DKTP为底物,考察不同重组氧化还原酶对DKTP的催化活性和选择性,进一步对高选择性酶促合成(S)-DHTP的重组酶CR2进行性质分析,并考察其在最适条件下不对称还原DKTP的过程。【结果】筛选获得产物构型为(S)-型的催化活性最高的酶为CR2,该酶米氏常数Km为0.135 mmol/L,kcat/Km为3.689 L/(mmol·s),最适p H 8.4(0.1 mol/L三乙醇胺缓冲液),最适反应温度为35°C,在10-45°C条件下和p H 7.5-8.5较为稳定,Zn2+离子对酶活有促进作用。CR2催化DKTP不对称还原反应6 h后,DHTP的产率达92.1%、光学纯度达99.9%。【结论】基于活性和选择性分析,获得不对称还原DKTP的目标酶CR2,其催化特性有利于高立体选择性还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,从而为进一步提高酶促不对称还原DKTP的转化效率提供研究基础。     

A novel extracellular low‐temperature active phytase from Bacillus aryabhattai RS1 with potential application in plant growth

Bacillus aryabhattai RS1 isolated from rhizosphere produced an extracellular, low temperature active phytase. The cultural conditions for enzyme production were optimized to obtain 35 U mL^?1 of activity. Purified phytase had specific activity and molecular weight of 72.97 U mg^?1 and ～40 kDa, respectively. The enzyme was optimally active at pH 6.5 and 40°C and was highly specific to phytate. It exhibited higher catalytic activity at low temperature, retaining over 40% activity at 10°C. Phytase was more thermostable in presence of Ca²⁺ ion and retained 100% residual activity on preincubation at 20–50°C for 30 min. Partial phytase encoding gene, phy_B (816 bp) was cloned and sequenced. The encoded amino acid sequence (272 aa) contained two conserved motifs, DA[A/T/E]DDPA[I/L/V]W and NN[V/I]D[I/L/V]R[Y/D/Q] of β‐propellar phytase and had lower sequence homology with other Bacillus phytases, indicating its novelty. Phytase and the bacterial inoculum were effective in improving germination and growth of chickpea seedlings under phosphate limiting condition. Moreover, the potential applications of the enzyme with relatively high activity at lower temperatures (20–30°C) could also be extended to aquaculture and food processing. © 2017 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 33:633–641, 2017