鼠伤寒沙门菌spvBC基因编辑株的构建

利用λRed重组系统和pBAD原核表达载体构建鼠伤寒沙门菌spvBC质粒毒力基因修饰菌株,为深入探究沙门菌毒力基因spv的功能和致病机制及宿主抗感染免疫提供工具菌。以pKD4为模板,PCR扩增含spvBC同源臂的卡那霉素抗性基因以构建同源打靶片段,再将其电转入含有质粒pKD46的鼠伤寒沙门菌中进行同源重组,随后将质粒pCP20电转导入阳性转化子,消除卡那霉素抗性基因,PCR鉴定敲除株的构建。PCR扩增含酶切位点的spvBC基因片段,扩增产物与原核表达载体pBAD/gⅢ分别双酶切后连接构建pBAD-spvBC重组质粒,PCR筛选阳性菌落并测序鉴定。将构建成功的pBAD-spvBC重组质粒电转导入spvBC敲除株中,Western blot测定不同浓度L-阿拉伯糖诱导SpvB和SpvC蛋白表达情况。PCR结果表明鼠伤寒沙门菌spvBC基因敲除成功;PCR及测序结果表明pBAD-spvBC重组质粒构建成功,Western blot结果表明13 mmol/L L-阿拉伯糖可诱导SpvB和SpvC蛋白正常表达。λRed重组系统可用于沙门菌质粒上大片段基因的敲除,pBAD原核表达载体可用于沙门菌质粒上大片段基因的回补,丰富了细菌质粒的基因修饰和编辑策略。     

醛脱氢酶基因敲除的K.pneumoniae重组菌的构建

在利用KlebsiellapneumoniaeM5aL厌氧发酵甘油生产1,3丙二醇的过程中,一部分甘油通过氧化代谢途径经醛脱氢酶(ALDH)催化合成大量副产物乙醇,降低了1,3丙二醇的产量和得率。首次以醛脱氢酶ALDH为改造目标,利用同源重组技术获得了ALDH基因敲除的K.pneumoniae重组菌。首先,采用PCR的方法分别从K.pneumoniaeM5aL基因组DNA及质粒pBR322上扩增得到ALDH基因和四环素抗性基因(Tcr);然后将ALDH基因定向插入到质粒pUC18的多克隆位点得到中间载体pUC18ALDH,该载体与Tcr基因分别用AvaI和BsaAI双酶切后进行连接,得到ALDH基因敲除的重组载体pUCAT;经DNA测序及限制性酶切电泳分析,构建的载体由5′ALDHTcr3′ALDHpUC18组成,与设计结果相符;最后,利用该载体通过同源重组技术得到两株K.pneumoniae重组菌06231hb及06231hc,经菌落PCR及酶活鉴定,两株菌的ALDH基因均已缺失。与出发菌株K.pneumonaieM5aL相比,重组菌的乙醇合成浓度降低了43%～53%,1,3丙二醇合成浓度提高了27%～42%。     

利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因

目的：利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。方法：以伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi Ty2,S.ty2）基因组为模板扩增得到的同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化S.ty2;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过卡那抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以去除抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;通过PCR鉴定重组菌,并经透射电子显微镜分析表型。结果：在S.ty2中敲除了rfaH基因,经PCR扩增和序列测定正确;初步的表型分析表明突变体的鞭毛合成显著减少。结论：获得了S.ty2突变株,为将沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定了基础。     

λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株的构建

[目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvC。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvC同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛选阳性转化子。最后利用表达FLP重组酶的质粒p CP20,将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因消除,用PCR鉴定。Western Blot检测野生沙门菌和spvC敲除株感染的He La细胞ERK磷酸化水平。[结果]沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株构建成功,spvC敲除株感染的He La细胞内ERK磷酸化水平升高。[结论]成功构建沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株,验证了spvC基因的功能。     

肠出血性大肠杆菌毒力相关基因突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、espB、espD,构建3株突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增基因两翼的同源序列;将PCR产物插入pEASY-T1载体并测序,将测序正确的上、下游同源序列分步酶切,构建于pUC19-kan质粒上,经PCR获得两端同源序列中间嵌合卡那霉素抗性基因标记的线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术,敲除espA、espB、espD基因,之后转入pCP20质粒以去除抗性标记,最后测定突变株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、es pB、espD,获得3株突变株,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:为进一步研究espA、espB、espD基因在肠出血性大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用奠定了基础。     

一种基于温敏质粒的新型基因敲除方法

基于温敏型质粒而不用线性DNA的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因。以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组为模板扩增得到的ssaV基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒pHY304,共同构建同源重组载体;然后转化S.ty2,通过筛选得到带有抗性标记的重组菌。通过转入重组酶表达质粒pCP20,去除抗性标记,得到ssaV基因缺失的重组菌,并在 DNA 水平进行了鉴定。建立了一种改进的基于温敏质粒的沙门氏菌的基因敲除方法,此方法也值得在其他革兰氏阴性菌的基因敲除中尝试应用。     

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracis AP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水甲和蛋白质水半进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.     

山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达

以质粒pKF3为模板,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,连至pMD18T载体,构建得到pMD18PC。以质粒pQE60SDH为模板,扩增山梨糖脱氢酶基因sdh,与pMD18PC连接,得到pMD18PCSDH。将其用PvuⅡ酶切,回收含ptsG1catsdhptsG2的目的片段,电转化至JM109/pKD46,在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上对应区域发生同源重组,将基因ptsG敲除,替换为catsdh基因,获得整合sdh基因的JM109s。经检测JM109s具有山梨糖脱氢酶活性。以 ptsG基因上下游序列为引物,JM109s基因组DNA为模板进行PCR,扩增产物测序结果表明sdh基因染色体整合成功。     

大肠杆菌menA敲除对CoQ积累的影响研究北大核心CSCD

通过同源重组敲除大肠杆菌的men A基因,增加菌体Co Q合成量,用于构建Co Q高产菌株。以p KD4质粒为模板,PCR扩增kanr片段;在p KD46的辅助下,kanr片段转化大肠杆菌,利用抗生素筛选和PCR验证重组子;以紫外诱变菌为对照,发酵men A基因敲除菌株,分析Co Q种类和产量变化。成功获得men A基因敲除菌株,Co Q种类不变,产量增加约为38%。首次敲除men A基因,改良株Co Q产量得到提高,达到预期目标。     

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。     

esat6基因表达载体的构建及其在戈登链球菌中的表达

为了构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因表达载体并在戈登链球菌GP251中进行分泌表达, 以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板扩增esat6基因, 将esat6基因TA克隆到pMD18-T, 构建pMD18-esat6重组载体。酶切消化pMD18-esat6, 将esat6基因亚克隆到质粒PSMB104, 生成PSMB104-esat6重组载体, 用于转化感受态戈登链球菌表达菌株GP251。用Tricine-SDS-PAGE和Western印迹检测esat6蛋白的表达, 并用ELISA技术检测该蛋白     

一步法快速构建多片段连接的同源臂载体

目的：建立一种简便、高效,可一步完成多个片段连接,从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物,在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例,PCR扩增打靶用左右同源臂片段、示踪基因CMV-EGFP片段、载体骨架pMD19－T等4个片段,纯化后一起加入一个反应管中,并加入BsaⅠ限制性内切酶和T7DNA连接酶及相应缓冲液,进行酶切、酶连接共10～50个循环反应,一步构建含同源臂载体的质粒;产物经高温处理后,直接转化感受态细胞,并进行重组子PCR鉴定;对pMD19－T载体进行优化,突变载体上的BsaⅠ酶切位点,把示踪基因CMV-EGFP片段引入pHSG298－T载体,再选择不同的G160基因同源臂片段组合对构建系统进行验证。结果：重组质粒酶切和PCR结果表明,应用一步法可成功连接多个片段来构建含同源臂及示踪基因的克隆载体;用优化后的pMD19－T－O载体体系,在2d内即完成了6种各含4个片段的载体的构建。结论：多个基因片段一步无缝连接的方法简便、易行、可靠,不仅可快速构建某类载体系统,还可对基因进行精确的点突变,该系统可用于快速构建基因打靶载体。     

Construction and characterization of new cloning vehicles. III. Derivatives of plasmid pBR322 carrying unique Eco RI sites for selection of Eco RI generated recombinant DNA molecules.

In vitro recombinant DNA techniques were used to construct two new cloning vehicles, pBR324 and pBR235. These vectors, derived from plasmid pBR322, are relaxed replicating elements. Plasmid pBR324 carries the genes from pBR322 coding for resistance to the antibiotics ampicillin (Apr) and tetracycline (Tcr) and the colicin E1 structural and immunity genes derived from plasmid pMBI. Plasmid pBR325 carries the Apr and Tcr genes from pBR322 and the cloramphenicol resistance gene (Cmr) from phage P1Cm. In these plasmids the unique EcoRI restriction site present in the DNA molecule is located either in the colicin E1 structural gene (pBR324) or in the Cmr gene (pBR325). These vectors were constructed in order to have a single EcoRI site located in the middle of a structural gene which when inactivated would allow, for the easy selection of plasmid recombinant DNA molecules. These plasmids permit the molecular cloning and easy selection of EcoRI, BamHI, HindIII, PstI, HincII, SalI, (XamI), Smal, (XmaI), BglII and DpnII restriction generated DNA molecules.     

Construction and characterization of new cloning vehicles. IV. Deletion derivatives of pBR322 and pBR325

In vitro recombinant DNA experiments involving restriction endonuclease fragments derived from the plasmids pBR322 and pBR325 resulted in the construction of two new cloning vehicles. One of these plasmids, designated pBR327, was obtained after an EcoRII partial digestion of pBR322. The plasmid pBR327 confers resistance to tetracycline and ampicillin, contains 3273 base pairs (bp) and therefore is 1089 bp smaller than pBR322. The other newly constructed vector, which has been designated pBR328, confers resistance to chloramphenicol as well as the two former antibiotics. This plasmid contains unique HindIII, BamHI and SalI sites in the tetracycline resistance gene, unique PvuI and PstI sites in the ampicillin resistance gene and unique EcoRI, PvuII and BalI sites in the chloramphenicol resistance gene. The pBR328 plasmid contains approx. 4900 bp.     

低温菌启动子探针质粒的构建

为了在宿主菌Acinetobacter sp.DWC6中构建低温菌蛋白表达载体,以pBR322质粒为基础,去除质粒上β-内酰胺酶基因的启动子片段,取而代之为来源于质粒pJRD215的卡那霉素抗性基因片段,并在pBR322中插入Acinetobacter菌属特异性ori的DNA片段,构建了能在Acinetobacter sp.DWC6和E.coli中正常复制的启动子探针质粒pBAP1。通过在质粒pBAP1中的β-内酰胺酶基因上游随机导入Acinetobacter sp.DWC6基因组片段,通过检测宿主细胞的氨苄青霉素抗性和β-内酰胺酶活性,来筛选强启动子片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。     

人神经元素3基因重组逆转录病毒表达载体的构建及其包装细胞株的建立

为构建表达人神经元素3基因(neurogenin 3,ngn3)的重组逆转录病毒载体,建立稳定表达ngn3的包装细胞株,本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料,通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因,将其连接到pMD18-T载体上并测序,结果表明,测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列(GenBank Accession No.BC126468)完全一致。将EcoRI和HpaI双酶切后的基因片段构建到pMSCV-neo逆转录病毒载体中,酶切鉴定结果表明,pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将pMSCV-ngn3重组载体导入PT67包装细胞,G418筛选后,对得到的细胞株进行RT-PCR和免疫组化检测,结果显示,该细胞株在mRNA水平和蛋白水平均稳定表达Ngn3;收集该细胞株的培养上清液,进行RT-PCR检测及电镜观察,结果表明,该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pMSCV-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒,并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明PT67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立,为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。     

猪链球菌2型溶血素基因与38KDa蛋白基因克隆及联合表达

目的:研究有效的猪链球菌病疫苗。方法:以四川株猪链球菌2型基因组DNA为模板分别扩增溶血素基因和38KDa基因主要功能区基因;并经连接、克隆及酶切鉴定。分别构建原核表达载体pET32a-Sly、pET32a-38KDa,提取阳性克隆质粒分别进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片断,将目的片断定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为60Ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western-blotting)证实该重组蛋白可以与SS2阳性血清发生特异性反应。结论:本研究为重组蛋白的免疫保护应用奠定基础。     

Highly efficient yeast-based in vivo DNA cloning of multiple DNA fragments and the simultaneous construction of yeast/ Escherichia coli shuttle vectors

In vivo recombinational cloning in yeast is a very efficient method. Until now, this method has been limited to experiments with yeast vectors because most animal, insect, and bacterial vectors lack yeast replication origins. We developed a new system to apply yeast-based in vivo cloning to vectors lacking yeast replication origins. Many cloning vectors are derived from the plasmid pBR322 and have a similar backbone that contains the ampicillin resistance gene and pBR322-derived replication origin for Escherichia coli. We constructed a helper plasmid pSUO that allows the in vivo conversion of a pBR322-derived vector to a yeast/E. coli shuttle vector through the use of this backbone sequence. The DNA fragment to be cloned is PCR-amplified with the addition of 40 bp of homology to a pBR322-derived vector. Cotransformation of linearized pSU0, the pBR322-derived vector, and a PCR-amplified DNA fragment, results in the conversion of the pBR322-derived vector into a yeast/E. coli shuttle vector carrying the DNA fragment of interest. Furthermore, this method is applicable to multifragment cloning, which is useful for the creation of fusion genes. Our method provides an alternative to traditional cloning methods.     

牛sox2基因的克隆及重组反转录病毒载体的构建

为了构建包含牛sox2基因编码序列的重组反转录病毒载体,获得有感染性的病毒颗粒,本研究以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛sox2基因的开放阅读框序列,将其亚克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明获得的基因片段与发表的牛sox2基因序列(Gen Bank Accession No.NM-001105463)高度同源;将测序正确的重组T载体用EcoRI和BglII酶切,基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo的相同酶切位点,成功构建了重组反转录病毒载体pMSCV-sox2。采用脂质体法用pMSCV-sox2转染包装细胞PT67,同时用pMIG(含绿色荧光蛋白)作为阳性对照,经流式细胞仪测定,该载体转染效率达到68.3%;转染后PT67细胞经G418筛选得到稳定的产毒细胞株,其病毒滴度达8.16×107CFU/mL,为下一步特定因子诱导牛体细胞转变为牛iPS细胞的研究奠定了基础。     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.