黒腹果蝇中嵌合新基因的进化命运和表达模式

新基因的起源和进化对基因组多样性的产生具有重要的贡献.新基因起源常常通过外显子重排而形成嵌合的基因结构,以产生具有新功能的蛋白质.该文调查了在黒腹果蝇中的14个新起源的嵌合基因在群体中的多态性,发现其中8个在群体中的核苷酸多态性会引起提前终止子,而其他6个在群体中编码框都完整且其中4个受到负选择.研究结果表明,嵌合新基因起源后可能存在两种命运:积累提前终止子突变而假基因化,或者表现出一定功能而受自然选择固定下来.基因表达的数据显示,与RNA介导外显子重排(逆转座)形成的新基因不一样,这些由DNA水平外显子重排产生的新基因没有精巢或者雄性特异性表达模式,而是表现出更为多样性的时空表达模式,这提示尽管通过DNA水平外显子重排产生的新基因可能正在变成假基因或者非蛋白质编码的RNA基因,但它们依然可能具有进化出广泛的生物学功能的潜力.     

嵌合RNA在肿瘤中的生物学意义

嵌合RNA(chimeric RNA)是来自不同基因的外显子片段通过一定的染色体重排或转录剪接机制形成的融合转录本，具有编码新RNA和/或蛋白质的潜能。嵌合RNA广泛存在于肿瘤和正常组织中，但不同的组织、细胞甚至分化的不同时间点都可能有其独特的嵌合RNA表达谱。目前，对嵌合RNA的研究尚处于起步阶段，其相关定义和术语尚不明确，因此，本文将对其进行统一规范。此外，为了从多维度认识“嵌合RNA”,本文将对嵌合RNA的形成机制和分类，以及其在肿瘤发生发展中的作用机制及其在不同肿瘤中的功能和应用进行详细论述。研究表明，嵌合RNA可编码一定的基因产物，在调控细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等方面发挥重要作用。在肿瘤中，嵌合RNA可编码特异性蛋白质，通过改变细胞表型，或者直接以非编码嵌合RNA的形式影响基因的表达或调控通路，导致癌症的发生。基于此使得嵌合RNA及其编码产物有望成为诊断癌症的重要标志物和药物治疗的有效靶点。近年来，已在不同肿瘤中发现了多种特异性嵌合RNA,它们在疾病的发生和进展中发挥了重要的作用。目前，已有嵌合RNA及其产物作为分子靶标成功应用于临床诊断和治疗，或者评估疾病的预后。本文将...     

应用嵌合基因实例拓展遗传学染色体畸变的教学

染色体结构变异,会扰乱机体的固有平衡系统,影响生殖和发育。在本科遗传学教学中,如何进一步诠释导致机体平衡系统紊乱的机理,是教师常面临的教学难题。一些嵌合基因(chimeric gene)是染色体结构变异的产物,具有特异的生物功能,可能是致使固有平衡系统紊乱的原因之一,但很少见到在课堂或教科书中讲述与嵌合基因相关的内容。本文结合近年本团队对嵌合基因的研究成果及遗传学教学实践,以一个司法案例创设情境,引入嵌合基因实例,以激发学生的学习兴趣;进而通过对嵌合基因通性的梳理,辅助学生总结知识点,发展思维融汇力,从而拓展染色体畸变的教学,以期使学生对基因的变异及其功能有更深入的理解,提高遗传学教学效果。     

嵌合RNA的形成机制及生物学意义

传统观念认为,嵌合RNA只是由染色体重排导致的基因融合,且融合基因及其产物(RNA和蛋白质)曾被认为是癌症的独有特征。然而,随着测序技术的进步和生物信息学软件工具的开发,通过对RNA-Seq数据库分析,越来越多的嵌合RNA被分离和鉴定出来。近年的研究表明,嵌合RNA并不是癌症所特有的现象,它广泛存在于人类多种正常组织和细胞中。除了染色体重排之外,嵌合RNA还有多种不同的分子形成机制,包括相邻基因的顺式剪接和反式剪接等。未发生染色体改变的嵌合RNA在转录水平上受到调控,从而呈现出独特的调控模式,其失调可能影响细胞分化并诱导肿瘤的发生。此外,嵌合RNA还发挥特定的生理功能,包括影响正常细胞生长和迁移能力,调控细胞周期及凋亡。通过影响染色体重排从而诱导基因组畸变,亦可作为潜在的竞争性内源RNA,以及影响干细胞的分化等。了解嵌合RNA在组织和细胞发育不同阶段的特异性表达,将有助于发掘潜在的临床诊疗生物标志物。深入且准确地对嵌合RNA的组织学图谱进行研究,可能实现从崭新的视角对特定细胞类型进行嵌合RNA治疗。越来越多的实验数据表明,嵌合RNA广泛存在于癌症和正常组织中,且具有重要的生理功能,其表达水平和模式也是高等动物拓展基因组功能的方式之一。     

含人抗体恒定区基因的酵母表达质粒的构建

本文主要报告了用以表达人-鼠嵌合抗体基因的酵母表达载体的构建、筛选与鉴定的研究结果.作者利用高度表达的酵母质粒YEP_(51),与含人抗体恒定区基因的pSV_2gptHuG_4两个质粒为材料,构建成可以供表达任何小鼠单克隆抗体的可变区基因,以构成嵌合的人-鼠抗体基因,用酶切回收插入DNA片段、原位和斑点杂交法对重组质粒予以鉴定和筛选,获得了pYEP-H重组的酵母表达载体.     

人鼠嵌合抗体重链基因转染小鼠骨髓瘤细胞的初步研究

本文介绍了通过人鼠嵌合抗体重链基因转染小鼠骨髓瘤J558L的研究,叫详尽地阐述了用原生质体融合发将重组的人鼠嵌合抗体重链基因转染到J558L骨髓瘤细胞中,并用ELSA法检测转染子的过程和方法,同时简要地说明了影响转染率的一些因素。     

嵌合中国分离株基因的丙型肝炎病毒（1b／2a）细胞培养模型的建立

目的：建立嵌合中国分离株基因的丙型肝炎病毒（HCV）细胞培养模型。方法：利用3片段融合PCR的方法将中国HCV河北分离株（1b）的全长包膜蛋白基因引入JFH1（2a）株基因骨架,构建包膜蛋白基因区相互置换的嵌合HCV（1b／2a）全长基因组,经线性化后体外转录获得全长RNA,转染Huh7．5．1细胞系,用免疫荧光及蛋白印迹实验检测。结果：该RNA可以产生具有体外感染活性的嵌合HCV,且感染性可在共同培养的细胞间传播。结论：首次在国内建立了嵌合中国HCV分离株基因的HCV细胞培养体系。     

哺乳动物嵌合RNAs产生机制:cis-SAGe

嵌合RNAs是指由两个或两个以上独立基因(即亲本基因)融合产生的新RNAs。传统观点认为,嵌合RNAs都是染色体重排的结果。近年来研究发现,相邻基因间的顺式剪接(cis-splicing of adjacent genes,cis-SAGe)也是产生嵌合RNAs的重要机制之一。cis-SAGe是同一条染色体上位置相邻、转录方向相同的基因间发生转录通读,由此产生的初始转录本经过加工,形成了含有两个或多个亲本基因序列的嵌合RNAs。cis-SAGe最初是在肿瘤细胞中被鉴定出来,其在肿瘤发生中的潜在功能引起了研究者的广泛兴趣。随着研究的深入,人们发现cis-SAGe也广泛存在于正常组织中,可能是哺乳动物进化过程中产生新基因的一种重要机制。本文就cis-SAGe的剪接和表达特性、产生机制及其产物的功能等方面进行了综述,以期为人们全面了解cis-SAGe的研究概况及发展趋势提供参考。     

bcr/abl嵌合基因与白血病分子机制

bcr/abl嵌合基因是白血病ph染色体的分子基础,其表达的融合蛋白具有活跃的酪氨酸激酶活性,它与细胞信号传导功能有关的蛋白作用干扰细胞正常信号的传导,影响细胞生长或凋亡。bcr/abl在白血病中的作用机制的进一步阐明有助于白血病的治疗。     

毛柄短肠蕨红/蓝光嵌合光受体基因的克隆和蛋白质结构分析

Phytochrome 3 (PHY3) 是一种特殊的既能吸收红光/远红光又能吸收蓝光的嵌合光受体, 一些隐花植物利用 PHY3 提高在弱光环境下的光敏感性。但是, 有关植物嵌合光受体的序列信息极为匮乏。文章采用反向 PCR 法分离了蕨类植物毛柄短肠蕨红/蓝光嵌合光受体编码基因的全长序列。序列分析表明: 该基因没有内含子, 仅包含一个长度为 4 278 bp 的开放阅读框, 与铁线蕨 PHY3 的核苷酸序列具有 80％以上的一致性。该基因编码一个 1 425个氨基酸组成的蛋白质, 预测分子量为 157 kDa, 理论等电点 (pI) 为 6.29。结构分析表明, PHY3是由光敏色素和向光色素蛋白融合而成, 其 N 端序列与光敏色素 N 端序列类似, 包括 PAS、GAF 和 PHY 结构域, 负责结合吸收红光/远红光的藻蓝胆素生色团; 而 C端与完整的向光色素类似, 由 2 个 LOV和 1 个 Ser/Thr 激酶结构域组成, 可结合吸收蓝光/ UV-A 的生色团黄素单核苷酸 FMN。     

淀粉结合域与α-淀粉酶的融合表达及其酶学性质

利用RT-PCR从Rhizopus oryzaeGX-08总RNA中克隆到糖化酶的淀粉结合域(SBD)基因(sbd),将该基因片段插入α-淀粉酶(CN7A)基因cn7a的5′端构建融合表达质粒pSE-sbdcn7a。嵌合酶SBD-CN7A在Escherichia coliJM109表达,并经Ni-NTA、Sephacryl S300纯化。酶学性质研究表明:嵌合酶在最适作用条件方面与原始酶并无明显差别;在以生玉米粉为底物时,其比酶活提高了8.7倍,而以可溶性淀粉为底物时其比酶活是原始酶的1.8倍,Km也从3.784 g/L降低为2.234 g/L;嵌合酶在65℃下的半衰期从10 min缩短为4 min。结果表明,淀粉结合域SBD的融合赋予了α-淀粉酶CN7A水解生淀粉的能力。     

报告基因

报告基因(ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控,筛选得到转化体。作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:(1)已被克隆和全序列已测定;(2)表达产物在受体细胞中不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域,已使用的…     

重组T4噬菌体gp37基因可扩大其在沙门氏菌中的宿主范围

[目的]将T4噬菌体WG01宿主决定区的gp37基因片段,与另一株T4噬菌体QL01的相应基因进行同源重组,从而获得嵌合噬菌体并进行宿主谱分析,为阐明T4噬菌体的宿主谱形成机制以及快速筛选针对特定病原菌的噬菌体奠定了基础。[方法]通过同源重组的方法将WG01 gp37上的8个基因片段分别替换给QL01,用沙门氏菌作为宿主菌筛选嵌合噬菌体,并对嵌合噬菌体进行宿主谱、最佳感染复数、一步生长曲线和遗传稳定性测定。[结果]本研究共获得了5株嵌合噬菌体(QWA、QWC、QWF、QWG、QWFG)。宿主谱试验结果表明,与噬菌体QL01相比,嵌合噬菌体对21株沙门宿主菌分别可以多裂解7、8、4、10和9株菌,即嵌合噬菌体都获得了相对较宽的宿主谱,其中QWG的沙门氏菌宿主菌拓宽最多。生物学特性试验结果表明,嵌合噬菌体QWG生物学特性稳定。嵌合噬菌体QWG经连续传代培养20代,测序分析第1代和第20代嵌合噬菌体尾丝蛋白基因在传代过程中的稳定性,测序结果表明,嵌合噬菌体改造部分的基因能稳定遗传。[结论]用基因改造的方法可以产生宿主谱拓宽且能稳定遗传的嵌合噬菌体,为快速筛选针对特定病原菌的噬菌体提供了可能。     

嵌合中国河北株包膜蛋白基因的HCV细胞培养模型的传代分析

建立稳定的嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系,进行传代特性分析。本研究经体外转录获得嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)全长RNA,脂质体法转染Huh7.5-CD81细胞,连续传代培养,进行Real Time RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot、再感染试验与感染滴度检测及序列分析。结果表明:嵌合重组HCV RNA转染Huh7.5-CD81细胞后可产生感染性的病毒颗粒(HCVcc);传代过程中,Western blot可检测细胞内HCV蛋白的表达;IFA检测阳性细胞数逐渐增多,41d升至高峰,达80%~90%;Real Time RT-PCR检测传代细胞上清中HCV RNA拷贝数在104~107拷贝/mL;再感染实验嵌合HCVcc最高感染滴度为104ffu/mL。序列分析显示在传代后期嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变,导致6处氨基酸改变。结论嵌合中国河北株1b亚型包膜蛋白基因的HCV细胞培养体系可以产生具有感染性的嵌合HCV病毒颗粒,传代后感染性增强并且嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变。     

三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆

利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR。通过此融合片段两端引入的XbaI和XhoI酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cD-NA克隆,命名为pBR-XJ160YE1。该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变。间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达。提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆。此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具。     

HIV-1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备

旨在通过构建Gag的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV诊断及可能的疫苗制备提供试验基础。选定HIV-1 Gag基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blotting测定融合蛋白的表达,并免疫动物制备相应抗体。结果显示,构建的HIV-1 Gag多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长576bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为27kD,以包涵体的形式存在。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体IgG。ELISA和免疫荧光方法检测显示制备的多克隆抗体能具有特异性反应。成功构建和高表达了HIV-1 Gag多表位融合蛋白,纯化蛋白制备的抗体与HIV-1Gag有特异性结合。为进一步研究HIV-1奠定了试验基础。     

功能性抗HBsAg人—鼠嵌合抗体在昆虫细胞中的高效表达

经同源重组我们构建了同时含抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体重、轻链基因的双重组 ＢａｃＨＬ４．２。利用双重感染和双重组病毒感染秋粘虫Ｓｆ９细胞,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果说明嵌合抗体重、轻链同时在胞内得到了表达。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明两种情况均能在胞内组装成Ｈ２Ｌ２完整免疫球蛋白分子。ＥＬＩＳＡ和功能性免疫迷检测证明重组嵌合抗体与父本鼠源单抗ＯＨ３一样能特异性识别具有天然构象的ＨＢｓＡｇ,而不识别经     

汉滩病毒M和S基因不同拼接方式嵌合基因免疫效果的研究

本文在前期工作的基础上,构建了汉滩病毒76－118株M基因G2片段与S基因5'端0.7Kb片段的嵌合基因真核表达载体pcDNA3.1-G2S0.7及pcDNA3.1-S0．7G2;用该质粒免疫BALB/c小鼠,结果表明两种质粒免疫小鼠可同时诱导产生抗滩滩病核蛋白（NP)及糖蛋白（GP）特异性的抗体,且前者刺激产生的抗体效价明显高于后者。淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1-G2S0.7组免疫小鼠脾细胞时NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组,而pcDNA3.1-S0．7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖。这说明汉滩病毒M基因G2片段及S基因0.7Kb片段的嵌合基因既可刺激机体产生特异的抗汉滩病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异的细胞免疫应答。不同拼接方式对嵌合基因免疫效果有很大影响,嵌合基因G2S0．7这种拼接方式明显优于S0．7G2。     

bcr／abl嵌合基因与白血病分子机制

bcr/bal嵌合基因是白血病ph染色体的分子基础,其表达的融合蛋白具有活跃的酷氨酸激酶活性,它与细胞信号传导功能有关的蛋白质作用于干扰细胞正常信号的转导,影响细胞生长或凋亡,bcr/abl在白血病中的作用机制的进一步阐明有助于白血病的治疗。     

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)的结构蛋白,是HIV1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆,将env基因以正确的三联密码读框插入gag基因的下游,制备了HIV1gagenv嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒p75启动子和牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子的下游,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选,获得了2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV1gagenv嵌合基因。动物实验表明,gagenv嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。