青海湖盐单胞菌Ectoine合成基因簇ectABC的重组共表达

盐单胞菌属(Halomonas)通过胞内积聚有机相容溶质(Compatible solutes)来抵抗胞外的高盐渗透压。为了探究相容溶质Ectoine合成代谢相关基因的结构特征和异源共表达的可能性, 以青海湖盐单胞菌Halomonas sp. QHL1为材料, 通过高效液相色谱(HPLC)分析不同盐梯度下QHL1胞内Ectoine的积聚量, 并借助于染色体步移技术(Genome walking)捕获QHL1菌株的Ectoine生物合成基因簇ectABC, 利用分子克隆技术分析ectABC基因簇的异源重组表达(E.coli BL21)。研究结果表明: 胞内Ectoine的积聚量随着培养基中Na+浓度的增加而增加, 最大积聚量为167.1 mg/g细胞干重(1.0 mol/L Na+), 但菌体生长却受到高浓度Na+的强烈抑制作用。QHL1的ectABC操纵子全长序列为3580 bp, 结构基因ectA(579 bp)、ectB(1269 bp)与ectC (390 bp)串联排列。基于生物信息学预测分析, 两个启动子(70与38因子控制)和若干未知功能的保守模序(Motifs)存在于QHL1的ect操纵子上游。构建重组表达载体pET-28-ectABC, 并在E.coli BL21中异源表达ectABC基因簇(2438 bp)。SDS-PAGE结果显示EctA、EctB和EctC分别为27.2、52.5 和 20.8 kD, 与预测结果一致, 表明ectA、ectB和ectC基因能在E. coli BL21中实现异源共表达, 为构建Ectoine合成代谢基因整合的系统代谢工程, 并实现低盐发酵控制和过量化生产提供了重要的理论基础。       

盐单胞菌属BYS1四氢嘧啶合成基因ectABC克隆及其盐激表达

利用SEFA-PCR技术从中度嗜盐菌Halomonassp.BYS-1总DNA中克隆了四氢嘧啶合成基因ectABC及其上游序列(GenBank accession number DQ017757);OMIGA软件分析结果显示ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,大小分别为573bp1、251bp和387bp,预测编码的DAT(L-二氨基丁酸转氨酶)、DAA(L-二氨基丁酸乙酰转移酶)和ES(四氢嘧啶合酶)大小分别为21.1kDa(191 amino acid)、45.7kDa(417 amino acid)和14.5kDa(129 amino acid);将包含ectABC基因及其上游1000bp序列的片段克隆到pUC19中并转化E.coliDH5α,转化子E.coli(pUC19ECT)能够在盐激条件下合成四氢嘧啶,但其耐盐能力没有得到显著改善。     

南极深海底泥色盐杆菌属NJS-2 ectABC基因克隆及二氨基丁酸转氨酶ectA基因的表达

从南极深海底泥中分离筛选得到一株中性嗜盐菌Chromhalobacter sp.NJS-2,以该菌株基因组为模板,利用PCR技术扩增出ectABC基因,基因全序列大小为2378bp。OMIGA软件分析该基因序列上含有三个阅读框,大小分别为576bp、1272bp和393bp,预测其分别编码二氨基丁酸乙酰转移酶（EctA）、二氨基丁乙酸转氨酶（EctB）和四氢嘧啶合酶(EctC)。将二氨基丁酸乙酰转移酶ectA基因的PCR扩增产物克隆至表达载体pET-his, 构建重组表达载体pET-his-ectA,并经酶切、PCR鉴定和测序验证,结果表明其目的基因的插入位置、大小和读码框均正确。SDS-PAGE分析,出现大小约21kDa的目的蛋白条带。     

中度嗜盐菌四氢嘧啶合成基因的克隆与功能分析

中度嗜盐菌Bacillus alcalophilus DTY1分离自晋西北黄土高原盐碱土壤, 能够产生耐盐相关的相容性溶质四氢嘧啶。为了研究四氢嘧啶的功能, 克隆了DTY1菌株四氢嘧啶合成基因簇ectABC。ectA、ectB和ectC分别编码169、428和132个氨基酸的肽链, 分别与B. halodurans C-125中的二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)同源性达59%、81%和81%。将携带该基因簇的4.0 kb片段转入蜡质芽孢杆菌B. cereus Z后, 芽孢杆菌的耐盐度显著提高。HPLC检测发现, 在1.0% NaCl浓度下, 转化菌B. cereus Z-E菌株生成70.1 mg/g四氢嘧啶, 而在5.0%的NaCl浓度下四氢嘧啶的产量高达118.6 mg/g, 显著高于B. alcalophilus DTY1的四氢嘧啶产量。而且随着盐浓度的提高, 四氢嘧啶的合成量也随之提高。由此证明四氢嘧啶参与中度嗜盐菌重要的渗透调节, ectABC的表达受盐诱导。     

中度嗜盐菌四氢嘧啶合成基因的克隆与功能分析

中度嗜盐菌Bacillus alcalophilus DTY1分离自晋西北黄土高原盐碱土壤, 能够产生耐盐相关的相容性溶质四氢嘧啶。为了研究四氢嘧啶的功能, 克隆了DTY1菌株四氢嘧啶合成基因簇ectABC。ectA、ectB和ectC分别编码169、428和132个氨基酸的肽链, 分别与B. halodurans C-125中的二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)同源性达59%、81%和81%。将携带该基因簇的4.0 kb片段转入蜡质芽孢杆菌B. cereus Z后, 芽孢杆菌的耐盐度显著提高。HPLC检测发现, 在1.0% NaCl浓度下, 转化菌B. cereus Z-E菌株生成70.1 mg/g四氢嘧啶, 而在5.0%的NaCl浓度下四氢嘧啶的产量高达118.6 mg/g, 显著高于B. alcalophilus DTY1的四氢嘧啶产量。而且随着盐浓度的提高, 四氢嘧啶的合成量也随之提高。由此证明四氢嘧啶参与中度嗜盐菌重要的渗透调节, ectABC的表达受盐诱导。     

嗜盐细菌中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生物合成及其生物学功能

在嗜盐细菌盐适应中,四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)和羟基四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸)发挥着十分重要的作用。四氢嘧啶的生物合成以L-天冬氨酸-β-半醛(ASA)为底物,依次由2,4-二氨基丁酸转氨酶(EctB),2,4-二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)和四氢嘧啶合成酶(EctC)催化反应,分别生成L-2,4-二氨基丁酸(DABA),N-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸(ADABA)和四氢嘧啶。羟基四氢嘧啶则由四氢嘧啶羟化酶(EctD)将四氢嘧啶羟基化产生。通常,四氢嘧啶合成基因以ectABC基因簇的形式存在,而羟基四氢嘧啶合成基因ectD单独存在。四氢嘧啶生物合成基因在微生物菌株和转基因经济作物中的表达可以提高其耐盐碱旱等抗逆能力,羟基四氢嘧啶合成基因的表达可以增强宿主耐热和耐干燥的能力。四氢嘧啶类相容性溶质的生物学功能及其潜在应用已成为前沿性研究热点。     

新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2中四氢嘧啶合成基因簇ectABC的克隆及其功能鉴定

研究旨在克隆新的四氢嘧啶合成基因簇,并对其功能进行鉴定,为应用于四氢嘧啶的生产奠定基础。从新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2中克隆获得四氢嘧啶合成基因簇ectABC,ectABC与表达载体pBAD连接后转化至大肠杆菌BW25113中,通过L-阿拉伯糖诱导表达。采用SDS-PAGE和液质联用鉴定重组表达蛋白,利用全细胞催化合成四氢嘧啶,通过高分辨质谱鉴定四氢嘧啶,并从天冬氨酸浓度、KCl浓度、温度和pH 4个方面优化催化条件。结果表明,来自新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2 基因组的ectABC大小为2 235 bp。SDS-PAGE显示表达产物中有3个重组蛋白产生, 液质联用鉴定表明其分子量分别与ectA、ectB、ectC的理论分子量一致。高分辨质谱分析发现全细胞催化上清中有四氢嘧啶产生。优化后的最适全细胞催化条件为：天冬氨酸浓度100 mmol·L^-1,KCl浓度100 mmol·L^-1,温度30 ℃,pH 7.0,最优条件下产量为1.11 mg·mL^-1。研究从弧菌中克隆了四氢嘧啶合成基因簇ectABC,并在大肠杆菌BW25113中实现了异源表达和低盐环境下的四氢嘧啶合成,为大规模发酵生产四氢嘧啶奠定了基础。     

交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆

从深海样品ESO109中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3,16SrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp．)的Pseudoalteromonas citrea和Pseudoalteromonas elyakovii的同源性为99％。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因celX全长1479bp,编码一个492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Rseudoalteromonas haloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有95％的相似性,包括一个糖基水解酶家族5的催化结构域,一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现,CelX的最适温度为40℃,酶的最适pH在6～7之间。     

稀有海洋放线菌Salinispora arenicola非核糖体肽合成酶和卤代酶生物合成基因簇核心区的克隆及序列分析

克隆稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的非核糖体肽合成酶(NRPS)和卤代酶生物合成基因簇核心区基因片段。根据已发表的放线菌NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区的核苷酸序列保守区设计两对简并性引物,采用PCR的方法扩增NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区基因片段,使用分子生物学软件进行序列分析。获得两段大小分别为662bp和557bp的基因片段,编码220个和185个氨基酸。这两段序列与海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205的NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区基因核苷酸序列的同源性分别为99%和98%。成功地获得了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区基因片段,该基因片段的获取将为分离全长基因簇以及研究该基因簇在生物合成中的功能奠定基础。     

苏云金芽胞杆菌γ-氨基丁酸代谢途径相关功能基因的克隆、表达及同源性分析

γ-氨基丁酸代谢旁路作为三羧酸循环的一个分支,在真核、原核生物中广泛存在。在这条代谢途径中,涉及γ-氨基丁酸分解代谢的主要有两种酶:一种是γ-氨基丁酸转氨酶,能将γ-氨基丁酸转变成琥珀酸半醛;另一种是琥珀酸半醛脱氢酶,该酶能将琥珀酸半醛氧化形成琥珀酸,后者进入三羧酸循环。从国内分离得到的苏云金芽胞杆菌G03菌株中克隆了gabT和gabD基因。其中gabT基因含有1440bp,编码一个大小为52.6kD的蛋白质,而gabD基因大小为1449bp,编码一个52.2kD的蛋白质。这两个基因都分别在大肠杆菌中进行了表达和纯化。通过酶活测定结果表明,GabT和GabD蛋白分别呈现出γ-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶的活性。氨基酸序列同源性比对分析发现,这两个蛋白质在蜡样芽胞杆菌群(B.cereus group)中具有较高的相似性,而与枯草芽胞杆菌的相似性较低则分别为58%、51%。为进一步深入研究γ-氨基丁酸代谢旁路在苏云金芽胞杆菌中的生物学功能及其转录调控机制奠定了基础。     

中度嗜盐菌DTY1的鉴定及其耐盐机制的初步分析

菌株DTY1分离自山西省五寨县柠条种植区盐碱土壤,可在0~1·2mol/LNaCl的浓度培养基上生长,最适生长温度32℃,最适pH7~10。通过形态观察,生理生化测定与16SrDNA序列分析,将该菌株鉴定为嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)。高压液相色谱分析,DTY1菌株在常规LB培养液中能够产生1·40mg/g四氢嘧啶,且在最适盐浓度条件下,盐浓度越高单位干重菌体所产生的四氢嘧啶含量越高。通过PCR介导的方法从DTY1的基因组文库中克隆到四氢嘧啶合成基因ectB。该基因长度为1284bp,编码427个氨基酸的肽链。此肽链与B.haloduransC-125(BAB04638)中二氨基丁酸氨基转移酶同源性达81%。ectB基因可能存在典型的σ70启动子,而且在启动子间有一段明显的23bp的回文序列。     

土壤假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶的基因克隆和原核表达及其酶活分析

亚磷酸盐脱氢酶(PTDH)以NAD+为辅助因子催化亚磷酸盐氧化生成正磷酸盐和NADH,在辅酶再生和基于亚磷酸盐的磷利用等方面有着潜在重大的应用价值。以土壤宏基因组DNA为模板,采用两轮PCR扩增得到全长亚磷酸盐脱氢酶基因PsPtx。通过酶切将它克隆到质粒pET32a(+)中,构建了原核表达载体pET(PsPtx)。序列分析表明,PsPtx基因的完整编码区大小为1 011 bp,其推导蛋白由336个氨基酸组成,理论分子量大小为36.5 kD。保守结构域预测分析表明PsPtx编码蛋白属于亚磷酸盐脱氢酶,含有保守的NAD+结合基序和催化功能残基。系统进化树分析显示PsPtx基因来源于一无法确定种名的土壤假单胞菌。另外,PsPtx基因经IPTG诱导能在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,重组PsPtx蛋白用组氨酸标签亲合层析纯化,其以亚磷酸钠盐为底物的酶比活性为3.75 U/mg。该PsPtx功能基因的获得为其后续应用研究打下了必要的基础。     

南极深海底泥中度嗜盐菌盐单胞菌属Nj223 ectC基因的克隆表达及ectoine合成酶性质分析

从南极深海底泥中筛选得到一株中度嗜盐菌Halomonas sp.Nj223,利用PCR技术,以该菌株基因组为模板,扩增出ectC基因。将目的基因的PCR扩增产物克隆至表达载体pET-his。经酶切、PCR鉴定、测序验证结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,表达载体构建成功。经SDS-PAGE分析,出现预期大小的目的蛋白条带。分离纯化复性的ectoine合成酶后测定其酶活力,在体外验证了ectoine的部分生物合成途径。进一步分析了pH和温度对酶活的影响发现,该酶最适pH为8.0,最适温度为25℃。     

北极海洋链霉菌604F的卤化酶基因克隆及特征

【目的】本研究旨在克隆来自北极海洋、具有合成卤化物潜力的链霉菌(Streptomyces sp.)604F中的一个卤化酶基因,为后续克隆卤化物合成基因簇、分离鉴定卤化物提供指导。【方法】利用琼脂块法初步测试抗菌活性,借助液相色谱-飞行时间串联质谱技术(LC-Tof MS)初步寻找Streptomyces sp.604F发酵粗提液中的卤化物,并以简并PCR扩增合成次级代谢产物的指示基因(I型、II型聚酮合酶及非核糖体多肽合成酶编码基因);根据依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的卤化酶基因保守区设计的简并引物,扩增基因片段并测序分析;采用高效热不对称交错PCR(hiTAIL-PCR)技术扩增卤化酶基因全长。【结果】Streptomyces sp.604F具有较强的抗白色念珠菌活性,其基因组同时含有编码I型聚酮合酶、II型聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因,以及卤化酶基因;通过染色体步移克隆该卤化酶基因全长,共1443 bp,编码一个新的非色氨酸卤化酶,在合成已知卤化物的卤化酶数据库中,与其同源关系最近的为一类参与合成糖肽类次级代谢产物的卤化酶。【结论】Streptomyces sp.604F具有新的非色氨酸卤化酶,且推测参与糖肽类化合物的卤化修饰,为后续寻找目的卤化物提供了指导,也为研究该合成基因簇奠定基础。     

SCCmec遗传元件及其在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型中的应用

携带mec基因簇的葡萄球菌盒式染色体(Staphylococcal chromosome cassette mec, SCCmec)遗传元件的获得是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)耐药的主要原因。SCCmec由一个mec基因簇、一个染色体重组酶(ccr)基因簇及3个J区组成。mec基因簇含有mecA及其调控基因,mecA基因编码的耐药决定簇使MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药;ccr基因簇编码的重组酶负责SCCmec元件的整合与切离;J区差异大,导致不同来源MRSA菌株携带SCCmec的大小不一,在组成上也具有多样性。这些特征为利用SCCmec元件进行MRSA分型创造了条件。文章介绍了SCCmec元件的结构和功能,综述了基于SCCmec的MRSA分型研究。     

盐角草和盐芥3个超氧化物歧化酶基因的克隆和功能分析

为了探究盐生植物的耐盐机制,比较不同盐生植物超氧化物歧化酶(SOD)基因耐盐性的大小,采用RACE技术克隆了盐角草锰和铜/锌两种SOD的cDNA全长。序列分析表明,盐角草MnSOD基因(SeMSD,GenBank登录号为JQ061158)含有699bp的开放阅读框,编码一个长233个氨基酸的多肽,其预测相对分子量为25.7kD。Cu/ZnSOD基因(SeCSD,GenBank登录号为JQ061160)开放阅读框长为684bp,并编码228个氨基酸的多肽,相对分子量为23.3kD。根据已获得的这两个cDNA序列和GenBank公布的盐芥MnSOD基因序列(ThMSD,EF140719),构建了3个原核表达载体pET30a-SeMSD、pET30a-SeCSD和pET30a-ThMSD,并将它们转化大肠杆菌BL21,成功表达出了目的蛋白。通过优化IPTG的诱导浓度,在6.5%和7.5%盐度下对这3个SOD基因的耐盐能力验证结果显示,相比对照菌BL21(pET30a),转化了pET30a-SeMSD和pET30a-ThMSD载体的重组菌具有更高的耐盐性,而转化pET30a-SeCSD载体的重组菌没有表现出耐盐性的提高。     

交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆

从深海样品ES0109中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3, 16ＳrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)的Pseudoalteromonas citrea和Pseudoalteromonas elyakovii的同源性为99%。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因cel-X全长1479bp,编码一个492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Pseudoalteromonas haloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有95%的相似性,包括一个糖基水解酶家族5的催化结构域,一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现,CelX的最适温度为40 ℃,酶的最适pH在6～7之间。     

希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)二十碳五烯酸生物合成基因簇的钓取及鉴定

希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)是从海洋动物肠道分离得到的1株产二十碳五烯酸(Ecicosapentaenoic acid,EPA)的海洋细菌。利用PCR方法、Overlap PCR及Gibson Assemble技术克隆该菌中包含pfaA、pfaB、pfaC和pfaD的EPA生物合成基因簇,全长18.4 kb。序列分析表明所钓取的合成基因簇与来自希瓦氏菌SCRC-2738的EPA合成基因簇有88%的相似度,均编码聚酮合酶。以构建的低拷贝表达载体pACYC-Trc为骨架,通过Gibson Assemble技术构建EPA基因簇表达质粒pLYSCY03。钓取大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)细胞中的entD基因,克隆至表达载体pTrc99a中,构建成为重组质粒pLYSCY01。将两个表达质粒同时导入大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中,获得产EPA的工程菌株。结果表明,希瓦氏菌中含有EPA聚酮生物合成基因簇,大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中的entD基因可以替代pfaE基因与钓取的EPA合成基因协同合成EPA。     

可降解TCE的甲烷氧化菌16S rDNA与pmoCAB基因簇序列分析

甲烷氧化菌可高效催化甲烷和多种氯代烃降解,开展甲烷单加氧酶的基因簇序列分析研究有助于深入了解催化机理,并提升其在污染物生物降解领域中的应用价值。以甲烷为唯一碳源富集分离甲烷氧化菌,取5种氯代烃作为共代谢基质考察其降解情况,利用MEGE5.05软件构建基于16S r DNA的系统发育树对所选菌株进行初步鉴定,用半巢式PCR法分段扩增菌株的颗粒性甲烷单加氧酶(p MMO)基因簇并进行T-A克隆测序,通过Ex PASy计算p MMO三个亚基的理论分子量。筛选到了一株甲基孢囊菌Methylocystis sp.JTC3,在三氯乙烯(TCE)初始浓度为15.64μmol/L条件下,反应5 d后降解率可达93.79%。经扩增、测序、拼接得到了3 227 bp的pmo CAB基因簇序列,包括771 bp的pmo C基因、759 bp的pmo A基因、1 260 bp的pmo B基因和2个非编码中间序列,所对应γ、β、α亚基理论分子量分别为29.1 k Da、28.6 k Da和45.6 k Da。通过Blast比对发现Methylocystis sp.JTC3的pmo CAB基因簇序列与Methylocystis sp.strain M的pmo CAB一致性较高,其中pmo A的序列相对保守。JTC3菌株可高效降解TCE,对pmo CAB基因簇序列的详细分析可为p MMO活性中心特征、氯代烃类底物选择性等方面的深入研究提供信息数据基础。     

光合菌Rhodobacter sphaeroides 601hupT基因的克隆与功能分析

从紫色非硫光合细菌Rhodobacter sphaeroides 601的吸氢酶(hup)基因簇中,克隆了hupT基因,并对该基因进行了测序,分析了由其推测的氨基酸序列的同源性.hupT基因全长1 332 bp,编码一分子量约为48 23 kD的蛋白.将hupT基因引入大肠杆菌进行了体外表达.纯化基因产物HupT,并进行HupT的自身磷酸化分析.结果表明,HupT属于双组份调节系统中的组氧酸蛋白激酶.将hupT基因导入光合菌Rhodobacter capsulatus吸氢酶负调节基因突变株BSE8后.野生型吸氢酶的表型得以恢复,说明所克隆的R.sphaeroides 601中的hupT基因在吸氢酶的表达中起负调节作用.