小型猪胰淀素基因的多态性分析

目的探讨我国3个特有的小型猪品系,巴马小型猪,五指山小型猪,中国农大小型猪胰淀素（IAPP）基因多态性分布,为我国小型猪在2型糖尿病及代谢性疾病研究中的应用提供基础资料。方法提取3个品系小型猪血液基因组DNA,针对IAPP基因外显子3~内含子3的部分序列进行PCR扩增,产物鉴定、测序,统计分析基因多态。结果在所扩增的片段中共检测出2个SNPs位点,SNPs1：43G→A,位于外显子上,未引起的氨基酸的改变,突变发生在五指山猪（G/A杂合突变为16.7%,A纯合突变为83.3%）和中国农大猪（G/A杂合突变60%,A纯合突变为20%两个品系中。SNPs2：214C→T,位于内含子上,发生在五指山猪（T/C杂合突变为16.7%,T纯合突变为83.3%）和中国农大猪（T/C杂合突变为20%,T纯合突变为60%）两个品系中。结论在IAPP基因外显子3-内含子3的部分扩增序列中发现了2个SNPs位点,在3个品系小型猪中的分布不同。     

三个品系小型猪正常心电图的比较

目的建立清醒状态记录小型猪心电图的方法,并对3个品系小型猪6个导联心电图进行分析比较。方法选用4月龄广西巴马猪7头、5月龄五指山小型猪6头、中国农大小型猪10头,清醒状态下吊床保定,测定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL和aVF6个导联的心电图。结果3个品系小型猪心电图的波形与人相似,心率较快,在3个品系之间差别不明显,存在偶发性窦性心率不齐。广西巴马猪、五指山小型猪和中国农大小型猪的P-R间期分别介于0．08—0．10s、0．08—0．11s和0．08—0．11s;QRS波群分别介于0．04—0．06s,0．04—0．07s和0．04～0．05s。3个品系小型猪均有清晰的S-T段,偏移小于1mm。结论本研究获得了3个品系小型猪清醒状态时的心电图基本数据,经比较,3个品系之间无明显差异。     

SNP与Hbb基因多态性的关联性

目的从单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）水平探索小鼠生化标记基因Hbb多态性的形成机理。方法从DNA、RNA和蛋白多肽3个方面分析研究Hbb基因的多态性。结果基因组DNA中有4个SNP位点与Hbbd/s多态性相关：分别为外显子1中的2个T（G）,外显子2中的G（A）和外显子3中的A（G）;RNA水平有4个SNP位点与Hbbd/s多态性相关：分别对应为外显子1中的2个T（G）,外显子2中的G（A）和外显子3中的A（G）;蛋白多肽水平第13、20和139位氨基酸残基,即Cys/Gly、Ser/Ala和Thr/Ala间的转换与Hbb/s多态性相关,分别对应于外显子1中的2个T（G）和外显子3中的A（G）。结论第13、20和139位氨基酸残基,即Cys/Gly、Ser/Ala和Thr/Ala间的转换可能是Hbbd/s多态性的形成原因。     

三种小型猪线粒体DNA控制区的比较研究

目的分析五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪线粒体DNA控制区碱基序列,比较研究不同猪种的遗传标志。方法应用PCR技术分别对这三种小型猪的血液总DNA样品中线粒体DNA D-loop区进行扩增,测序比对。结果猪的线粒体DNA D-loop区分三个区域。I区（靠近5’端区域）704bp,五指山小型猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点中归纳出3个单倍体,而巴马小型猪在此区有9个变异位点,通过9个变异位点归纳出4个单倍体,贵州香猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点归纳出3个单倍体。Ⅱ区（串联重复序列区）,五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪序列相同。Ⅲ区（靠近3’端区域）三种小型猪的序列几乎相同。结论五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪三种小型猪之间线粒体DNA碱基序列变异位点较少,五指山小型猪和巴马小型猪亲缘关系较近。     

猪CD4基因多态性及生物信息学分析

本研究利用PCR-RFLP方法检测猪CD4基因部分外显子区的单核苷酸多态性,分析CD4基因SNPs之间的连锁不平衡程度,并采用生物信息学软件预测SNPs对CD4蛋白的潜在影响,为猪的抗病育种研究提供相应的分子标记。研究表明,大白猪CD4基因外显子4、6和7都存在一个突变位点,分别可使CD4蛋白T80S、P290L和M348I发生改变;每个SNP位点都有三种基因型,多态信息含量均处于中等多态(0.25PIC0.5)。三个SNPs呈强连锁不平衡状态(r~20.8),而且仅构成两种主要单倍型CTC和GCG型(两者的频率占99%以上)。经序列预测分析可知,两种CD4单倍型纯合子的理化性质和二级结构存在差异,但三个错义突变是否能影响猪CD4蛋白的功能需进一步研究。     

三种小型猪线粒体DNA控制区的比较研究

目的分析五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪线粒体DNA控制区碱基序列,比较研究不同猪种的遗传标志。方法应用PCR技术分别对这三种小型猪的血液总DNA样品中线粒体DNA D-loop区进行扩增,测序比对。结果猪的线粒体DNA D-loop区分3个区域。Ⅰ区（靠近5′端区域）704 bp,五指山小型猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点中归纳出3个单倍体,而巴马小型猪在此区有9个变异位点,通过9个变异位点归纳出4个单倍体,贵州香猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点归纳出3个单倍体。     

三品系小型猪35个微卫星基因座的遗传学研究

利用35个微卫星基因座对中国三个品系的小型猪（贵州小型香猪、广西巴马小型猪、版纳小耳猪近交系）进行了遗传检测。计算出三个小型猪品系个体样本在35个微卫星基因座的纯合率,并对其进行t检验。计算出各品系的平均杂合度,多态信息含量（PIC）及品系间的遗传距离,并进行了系统聚类。结果表明三个品系的小型猪其基因纯合率均较高,其中版纳小耳猪近交系的基因纯合率最高;PIC和平均杂合度均较低;贵州小型香猪和广西巴马小型猪亲缘关系较近,并均与版纳小耳猪近交系的亲缘关系略远。 Abstract：The polymorphism of 35 microsatellites in the three miniature pig breeds in China(Guizhou miniature pig, Guangxi Bama miniature pig, Banna miniature pig inbred) was analysed. Rates of homozygote for 35 microsatellite loci in three miniature pig breeds were calculated,and t-test for them were performed. Mean heterozygosity and polymorphism information content(PIC) were calculated for all breeds, and genetic distances between these breeds were estimated. The dendrograms were obtained based on genetic distances. The results suggest that rates of homozygote in the three breeds are all high, and that is the highest in Banna miniature pig inbred. The results also suggest that polymorphism information content and mean heterozygosity in all the three breeds are low, and the genetic relationship between Guizhou miniature pig and Guangxi Bama miniature pig is closer than their relationship with Banna miniature pig inbred.     

广西巴马小型猪presenilin-1基因克隆及多态性分析

本研究的目的是寻找广西巴马小型猪presenilin-1基因SNP位点,并确定各基因型频率。利用RT-PCR的方法扩增并克隆presenilin-1基因,通过测序和对比确定SNP位点,RFLP方法分析100头近交系和封闭群的广西巴马小型猪的基因组DNA,确定该突变位点的分布情况。结果显示,成功克隆广西巴马小型猪presenilin-1基因CDS区全长并确定T188C错义突变位点,SNP检测确定,在33头近交系中TT型占93.9%,TC型占6.1%;在67头封闭群中TT型占64.2%,TC型占35.8%,在封闭群和近交系中均未发现CC基因型。本研究成功验证了presenilin-1基因的SNP位点,为下一步研究presenilin-1基因T188C突变位点的功能奠定基础。     

两个品系普通级和SPF级小型猪部分血液学指标的比较

目的了解不同微生物控制程度（屏障环境和普通环境）对小型猪部分血液学和生化指标的影响。方法分别对10只SPF（无特定病原体）级五指山小型猪、10只普通级五指山小型猪和10只SPF级广西巴马小型猪1、0只普通级广西巴马小型猪测定13项血液学指标和21项血清生化指标。结果普通级小型猪红细胞数（RBC）、血球比积（HCT）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、高密度脂蛋白（HDL-C）低于SPF级小型猪,白细胞数（WBC）、天门冬氨酸转移酶（AST）高于SPF级小型猪（P〈0.05）;且部分指标在不同品种间有差别。结论普通级小型猪和SPF级小型猪部分血液学和血清生化指标等生物学特性存在显著差异。     

牛FSHR基因第10外显子单核苷酸多态性及其与双胎性状的关系

以秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎母牛和单胎母牛为实验材料 ,以牛的FSHR基因的第 10个外显子作为标记牛双胎性状的候选基因 ,用SNP法进行了多态检测 .结果发现 ,在秦川牛的双胎母牛中突变率 6 0 % (6 10 ) ,而在单胎母牛中突变率为 2 0 % (2 10 ) ;在荷斯坦奶牛中 ,双胎母牛突变率为31 2 5 % (5 16 ) ,单胎母牛突变率为 6 6 7% (1 15 ) ;由此可见双胎牛和单胎牛二者之间FSHR基因的第 10个外显子的突变率差异明显 .这表明 ,选择FSHR基因的第 10个外显子有可能作为双胎性状的候选基因 .序列分析发现 ,在FSHR基因的第 15 0 6位碱基发生了突变 (T→C) ,但氨基酸没有发生变化 .     

广州地区三种小型猪血液生理生化指标的比较

目的比较广州地区西藏小型猪、五指山小型猪和巴马小型猪血液生理生化指标的差异。方法全自动血液细胞和生化分析仪测定24个血液生理生化指标。结果 24个指标中,血红蛋白、白细胞、单核细胞、血细胞比容、葡萄糖指标的测定差异显著;淋巴细胞、中性粒细胞、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、血清总蛋白、血清清蛋白、血尿素氮、血肌酐指标的测定差异极显著。其中血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、血清总蛋白、血清清蛋白、血尿素氮、血肌酐指标以西藏小型猪最高,白细胞、淋巴细胞指标以五指山小型猪最高,而中性粒细胞、单核细胞、葡萄糖指标以巴马小型猪最高。结论三种小型猪血液生理生化指标的比较,为建立小型猪生物学特性数据库提供了理论依据。     

Analysis of Genome-Wide Copy Number Variations in Chinese Indigenous and Western Pig Breeds by 60 K SNP Genotyping Arrays

Copy number variations (CNVs) represent a substantial source of structural variants in mammals and contribute to both normal phenotypic variability and disease susceptibility. Although low-resolution CNV maps are produced in many domestic animals, and several reports have been published about the CNVs of porcine genome, the differences between Chinese and western pigs still remain to be elucidated. In this study, we used Porcine SNP60 BeadChip and PennCNV algorithm to perform a genome-wide CNV detection in 302 individuals from six Chinese indigenous breeds (Tongcheng, Laiwu, Luchuan, Bama, Wuzhishan and Ningxiang pigs), three western breeds (Yorkshire, Landrace and Duroc) and one hybrid (Tongcheng×Duroc). A total of 348 CNV Regions (CNVRs) across genome were identified, covering 150.49 Mb of the pig genome or 6.14% of the autosomal genome sequence. In these CNVRs, 213 CNVRs were found to exist only in the six Chinese indigenous breeds, and 60 CNVRs only in the three western breeds. The characters of CNVs in four Chinese normal size breeds (Luchuan, Tongcheng and Laiwu pigs) and two minipig breeds (Bama and Wuzhishan pigs) were also analyzed in this study. Functional annotation suggested that these CNVRs possess a great variety of molecular function and may play important roles in phenotypic and production traits between Chinese and western breeds. Our results are important complementary to the CNV map in pig genome, which provide new information about the diversity of Chinese and western pig breeds, and facilitate further research on porcine genome CNVs.     

巴马小型猪在医学研究中的应用进展简

广西巴马小型猪作为国内小型猪主要品种之一,具有遗传性稳定、多产、体重较小、体表多覆白毛等特征,组织器官及生化指标与人类相似,已越来越广泛地应用于医学研究领域：猪的心脏解剖与生理特点与人类高度相似,已被广泛应用于心血管系统研究中,在我国,巴马小型猪被用来构建心肌缺血、卵圆孔未闭等心血管疾病模型;猪具有杂食性及与人相似的脂质代谢,可用于研究内分泌疾病,巴马小型猪已用于糖尿病动物模型建立及其遗传易感性、并发症的防治研究等;巴马小型猪的消化系统与人类相似,利用此特点已建立阻塞性慢性胰腺炎、结肠穿孔、胆肠吻合等消化系统疾病模型;巴马小型猪除头、尾外,体表覆以白毛,这一特点使其成为研究皮肤创伤、烧伤修复等的理想动物;小型猪的牙齿解剖结构与人类相似,口裂大,可作为口腔医学研究中的理想动物,巴马小型猪已用来建立牙髓坏死模型及对上颌扩弓方式的研究;类似人的解剖、生理、病理使其成为较为适合的异种移植供体.在中医药研究方面,已用巴马小型猪分别建立了肝脏、脾脏、股动、静脉出血及头颈恶性肿瘤放疗后的腮腺损伤动物模型以研究中药制剂的疗效及机制.     

氟喹诺酮类药物体外诱导肺炎克雷伯菌耐药后GyrA和ParC的变异

目的了解3种氟喹诺酮类（FQS）体外诱导肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,Kpn）耐药性的差异,研究肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位（GyrA）和拓扑异构酶ⅣC亚基（ParC）的变异与其耐喹诺酮类药物的关系。方法采用环丙沙星（CW）、左氧氟沙星（LEX）和加替沙星（GAT）对从临床分离8株Kpn进行体外分步诱导,采用琼脂平板二倍稀释法测定CIP、LVF及GAT对Kpn诱导前、后的最低抑菌浓度（MIC）,并对诱导成功的17株Kpn的GyrA的基因（gyrA）和ParC的基因（parC）进行PCR扩增,选取其中8株KpnDNA测序并进行序列分析比较。结果8株耐FQS菌株都存在GyrA变异,同FQS耐药性相关的变异有Ser83（TCC）→Phe（TTC）、Ile（ATC）和Tyr（TAC）,Asp87（GAC）→Ala（GCC）、ma（GCC）和Glu（GAA）,5株Kpn同时存在ParC的变异：丝氨酸Ser80（AGC）→Ile（ATC）。结论本研究体外实验证实了Kpn可在长期低剂量的接触抗菌药物后形成耐药菌株。在高度耐FQS的Kpn中同时存在GyrA和ParC变异。     

实验用西藏小型猪CYP3A基因的克隆及序列分析

目的:克隆西藏小型猪CYP3A基因并与人及其它小型猪品种进行序列比对分析。方法:根据Genebank数据库设计引物,取西藏小型猪新鲜肝脏组织,Trizol法提取肝脏总RNA,应用RT-PCR反转获得肝脏cDNA。分别扩增基因CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39,PCR片段回收后分别连接pMD-18T载体,获得重组质粒pT-CYP3A,阳性重组克隆送测序。采用NCBI Blast及vector NTI软件进行序列比对分析。结果:CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39基因编码序列全长1512 bp,编码503个氨基酸,与人CYP3A4相同。其中CYP3A22和CYP3A39与NCBI记录巴马小型猪序列相同;CYP3A46与巴马小型猪CYP3A46(NM_001134824.1)有6个位点碱基不同。CYP3A29与巴马小型猪CYP3A46(EU918131.1)亦有6个位点碱基不同。对来自2个母本后代猪的基因经过PCR扩增后测序发现CYP3A46、CYP3A29序列完全一致。结论:成功克隆西藏小型猪CYP3A的4个基因,其中CYP3A46与人CYP3A4的序列相似性最高。所得CYP3A46与CYP3A29序列可能为西藏小型猪独有。     

基于遥测技术对巴马小型猪部分生理指标的观测

目的：应用遥测技术观察巴马小型猪在清醒自由状态下心电、血压、呼吸、活动等指标昼夜波动变化。方法取雄性6月龄巴马小型猪6只,行浅表股动脉VAP血管通路植入手术,恢复7 d后,用EMAK遥测系统进行24 h连续清醒自由状态下心电、血压、呼吸、活动指标监测,并用EMAK分析软件对上述指标进行分析。结果6月龄巴马小型猪心电、血压、呼吸、活动都有昼夜节律变化,白昼心率显著高于黑夜心率（ P ＜0.01）,且白昼PR间期、QRS间期与QT间期均显著低于黑夜（P ＜0.05,P ＜0.01）,白昼平均心率为76.22次/分,黑夜平均心率为67.03次/分,白昼平均PR间期、QRS间期和QT间期分别为109.97 ms、42.72 ms、380.37 ms,黑夜平均PR间期、QRS间期和QT间期为112.32 ms、44.01 ms、389.24 ms。巴马小型猪白昼收缩压、舒张压、平均压都显著高于夜间（ P ＜0.01）,白昼平均收缩压、舒张压、平均压分别为129.57 mmHg、96.75 mmHg、111.73 mmHg,夜间平均收缩压、舒张压、平均压分别为122.81 mmHg、92.65 mmHg、106.19 mmHg,且黑夜收缩压、舒张压、平均压下降率分别为19.89％、19.05％、19.35％。另外,巴马小型猪在白昼的活动情况与呼吸频率都要显著高于夜间（ P ＜0.01）。结论利用遥测技术可以对清醒自由状态下巴马小型猪心电、血压、呼吸、活动等进行连续监测,能真实的反应小型猪在24 h内上述生理指标的变化规律,为巴马小型猪在药理毒理研究中的应用提供参考。     

已建株鼻咽癌细胞的PLUNC基因启动子区序列多态性分析

目的检测人类标准鼻咽癌细胞中是否存在已知的PLUNC基因启动子-437bp-＋87bp区域的单核苷酸多态性（SNP）。以便进一步探索SNP与鼻咽癌的关系。方法采用PCR产物直接测序的方法,对7株体外培养的鼻咽癌细胞基因组DNA的PLUNC基因启动子区进行序列分析。结果发现7株PLUNC基因的启动子区皆存在已知的3个SNP位点（1888、2128和N2）和未知一个突变位点（N1）,其测观杂合度分别为85．7％、100％、100％和28．6％。其中3个已知SNP位点在筛查的细胞株中均存在T-C的突变,而且SUNE-1鼻咽癌细胞株的1888位点基因型为突变纯合子CC型。结论体外培养的标准鼻咽癌细胞株中存在已知的3个SNP位点（1888、2128和N2）的突变现象,且突变率为100％;1888位点鼻咽癌易患型（CC型）已在体外稳定建株;首次发现启动子-195bp区域N1突变位点。