三七的组织和细胞培养（简报）

在以6,7V为基本培养基,对云南产三七植株各部位进行愈伤组织诱导,其中以6,7V 2,4—D0.8mgL_(-1)为最佳培养基,愈伤组织再行继代培养后,筛出3个较优的无性系,首次获得粗根无性系,这个无性系经继代培养后其愈伤组织的生长速率和皂苷含量都高。     

三七愈伤组织的培养

在MS培养基中加入不同浓度的KT和2,4-D,综合考虑三七愈伤组织生长缓慢兼顾皂甙含量,较合适的KT浓度为0.7ppm,较合适的2,4-D浓度在2—3ppm之间。在培养基中补充各种添加剂,结果以椰子乳和水解乳蛋白较好。综合生长和皂甙含量以20％的椰子乳和0.7％的水解乳蛋白较合适。从21个三七愈伤组织无性繁殖系中筛选山了5个较优的无性系,特别是其中04号无性系更优,无论生长速率还是总皂甙含量都更高。通过以上研究,使三七愈伤组织的生长速率达220毫克/升/天,是原初培养愈伤组织(54.0mg干重/升/天)的4倍。愈伤组织中总皂甙含量高达13％,是原初培养愈伤组织(5.37％)的2.4倍,为原植物的3倍。从而证明了三七培养组织次级代谢的全能性是可调节的,为三七细胞工程的工业生产应用打下了初步基础。     

白背三七的组织培养和高频再生

以白背三七不同生长时间的叶片及茎段作为实验材料,利用含有多种不同植物生长调节剂及其浓度配比的MS培养基分别诱导愈伤组织、不定芽和根,建立了组织培养和高频离体再生体系。结果表明：（1）最适外植体为生长15d的叶片和茎段;（2）诱导愈伤组织的最适植物生长调节剂及其浓度配比为0．5mg·L-1 2,4．D、0．8mg·L-1 6-BA和0．1mg·L～NAA,茎段和叶愈伤组织的诱导率分别为95．6％和97．8％;（3）诱导不定芽的最适植物生长调节剂及其配比为1．0mg·L-1 6-BA、0．2mg·L-1 NAA和0．1mg·L-1 TDZ,诱导率可达87．4％;（4）以MS＋0．2mg·L-1 NAA作为生根培养基可获得100％的生根率。将生长良好的的植株进行移栽,存活率可达95％。     

裸燕麦胚性愈伤组织培养及悬浮系的建立

裸燕麦成熟胚在IN_６培养基上诱导培养,初始愈伤组织为白色、瘤状、外软内硬、易分化植株的非松脆类型。当在IM_１～IM₄培养基上进行循环式调控培养,经7～8个月,初始愈伤组织转变为浅黄色、小颗粒状、生活力强的松脆型胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织置于液体培养基中悬浮培养,得到分散性好、生长快的悬浮细胞系。悬浮系经分化培养获得了再生植株,移栽成活率达95%以上。     

朱砂根愈伤组织诱导及其岩白菜素含量的测定

取朱砂根(Ardisia crenota Sims．)幼苗不同部位作外植体,研究不同激素组合对愈伤组织诱导的影响,利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)检测愈伤组织中岩白菜素含量。实验结果表明朱砂根幼苗的不同部位(胚根、下胚轴、茎及叶)均能诱导出愈伤组织,最高诱导率都在45％以上,以MS基本培养基添加2,4—D0．5mg L^-1和KT0．01mg L^-1时愈伤组织的诱导和生长最好。这些愈伤组织均有合成岩白菜素的能力,其中以胚根诱导的愈伤组织中岩白菜素含量最高,为干重的0．076％,相当于原植物根中含量的1／9。高效液相色谱定量测定法精密度高,专一性好,能准确检测朱砂根愈伤组织中岩白菜素的含量。     

三七.人参和西洋参细胞悬浮培养的比较研究

用薄层层析对三七、人参和西洋参愈伤组织进行的初步鉴定表明,三种愈伤组织都含有皂甙和主要皂甙成分Rb_1、Rg_1,三七愈伤组织还含有一种抗癌皂甙Rh_1。对愈伤组织的生长,三七低于人参高于西洋参;对愈伤组织中总皂甙含量,三七均高于人参和西洋参。三种植物细胞悬浮培养结果类似于他们的愈伤组织培养,但生长又进一步提高。三七细胞悬浮培养中皂甙产生的时间进程几乎与生长平行,合适的收获期为培养30天。寡糖素不仅增强三七培养细胞的皂甙形成而且促进细胞生长,较合适的浓度为1.25 ppm。通过以上研究,使三七悬浮培养细胞的生长(干重增加178毫克)为最初培养愈伤组织的4倍以上,总皂甙产率高达20.6毫克,为最初培养愈伤组织的8.5倍。     

印楝愈伤组织形成及其印楝素含量测定

取印楝（AzadirachtaindicaA．Juss）不同器官作外植体,研究培养基和继代次数对愈伤组织生长及其印楝素（Azadirachtin）生物合成的影响．印楝的不同器官（根、叶、茎及皮）均能诱导出愈伤组织,这些愈伤组织均有合成印楝素的能力．其中以叶诱导的愈伤组织生长速率及印楝素含量为最高．含有较低按盐的B5培养基有利于细胞生长,含有较高铵盐的MS培养基有利于印楝素积累,不含铰盐的White培养基对两者均不利．愈伤组织继代2—3代,有利于愈伤组织生长和印楝素合成。     

土壤农杆菌转化的长春花冠瘿细胞培养

以土壤农杆菌C₅₈诱导的长春花冠瘿组织与从长春花茎、叶外植体诱导的愈伤组织进行比较,发现冠瘿组织在生长、总吲哚生物碱含量及药用成份阿吗碱含量等方面都优于愈伤组织。测定了光照、温度、蔗糖浓度及外加L－色氨酸前体等,对长春花冠瘿细胞的生长、总生物碱及阿吗碱含量的影响,为长春花冠瘿细胞培养生产吲哚生物碱的实际应用研究提供理论依据。     

培养条件对三七愈伤组织生长和皂苷积累的影响

以MS为基础培养基,改变激素配比、氮源和光照等因素,以分光光度法和HPLC法分析三七愈伤组织培养过程中皂苷含量的变化。结果表明:培养条件对三七愈伤组织中皂苷积累有一定影响,激素配比对愈伤组织中皂苷含量的影响最大,在0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA组合下,培养物中总皂苷含量最多,达到4.72%±0.29%;在总氮量为60 mmol·L-1条件下,45 mmol·L-1KNO3+7.5 mmol·L-1NH4NO3(NO3-/NH4+=7∶1)时,愈伤组织皂苷含量最多,达到4.71%±0.17%;分别在1 000 lx和500 lx光强下每天光照12 h的愈伤组织,皂苷含量均低于黑暗培养的愈伤组织,三者皂苷含量分别为1.94%±0.31%、2.38%±0.12%和3.57%±0.27%,光照引起愈伤组织表面变绿及细胞分化,可能是抑制愈伤组织中皂苷合成与积累的主要原因;HPLC检测发现,三七愈伤组织和根中均含有Rg1、Re、Rb1及Rd四种皂苷,但栽培三七根含有R1皂苷,而三七愈伤组织中未检测到R1,其原因需要进一步研究。该研究结果为未来愈伤组织培养成为部分代替人工栽培生产三七天然产物的潜在途径提供了研究基础。     

吉粳88高效再生体系的建立

以吉粳88为材料,通过对不同培养基和激素的筛选,确定最佳的再生体系。结果表明:NMB培养基为吉粳88最适的愈伤组织诱导培养基。通过L₉(3³)正交实验研究最适激素浓度配比,筛选出吉粳88愈伤组织诱导的最佳激素配比为2.0 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。在添加2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的NMB基本培养基条件下,吉粳88的分化率最高,成培苗率也最高。     

柑桔裂皮病类病毒一爪哇三七悬浮细胞的生长特性

爪哇三七(Gvnura aurantlaca Dc)是柑桔裂皮病类病毒(Citrus Exocortis Viroid简称CEV)敏惑的指示植物。用CEV感染的柑桔叶研磨汁液机械接种健康爪哇三七植株,以此作为CEV感染的外植体采源。在MS和B,琼脂培养基上诱导和继代培养健康、CEV感染的爪哇三七叶片的愈伤组织,在MS、B,液体培养基中建立健康、CEX’感染的爪哇三七悬浮细胞系统。从愈伤组织和悬浮细胞培养物中抽提核酸,经5％双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染分析：在健康爪哇三七愈伤组织和悬浮细晦中不出现特异的CEV电泳带,而CEV感染的爪哇三七的所有培养物中都含有类病毒。cEV可在有丝分裂征盛的爪哇三七悬浮细胞中复制。散伤组织和悬浮细胞很容易继代培养和保存。     

姜状三七根茎的皂苷类化学成分研究

为了解姜状三七(Panax zingiberensis)根茎的皂苷类化学成分,采用正相硅胶、反相硅胶和凝胶等色谱方法从其根茎的乙醇提取物中得到9个皂苷类化合物,根据理化性质和波谱数据,其结构分别鉴定为人参皂苷SL₁ (1)、人参皂苷Rh₁ (2)、三七皂苷R₈ (3)、竹节参皂苷IVa (4)、越南人参皂苷R₁₀ (5)、人参皂苷Rg₁ (6)、菠菜皂苷A 28-O-β-d-葡萄糖苷 (7)、齐墩果酸28-O-β-d-葡萄糖苷 (8)和姜状三七苷R₁ (9)。化合物1、3、5、7和8为首次从该植物中分离得到, 其中化合物5为奥克梯隆醇型皂苷,此类皂苷在该植物中未见报道。     

野葛叶片和茎段高频再生体系的建立

探讨几种因子对野葛叶片和茎段高频再生体系建立的影响。采用植物组织培养、正交实验和单因子实验的方法。野葛叶片和茎段的最佳消毒方式为70%酒精处理30 s后再用0.1%HgCl₂处理15 min;野葛叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+NAA 1.0 mg·L^-1+2,4-D 2 mg·L^-1,野葛茎段愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+NAA 0.5 mg·L^-1+6-BA 1.0 mg·L^-1+2,4-D 2 mg·L^-1;暗培养更有利于野葛愈伤组织的诱导;野葛叶片和茎段愈伤组织诱导的最佳蔗糖浓度均为30 g·L^-1;野葛叶片愈伤组织的最佳出芽培养基为MS+NAA 1.0 mg·L^-1+6-BA 3.0 mg·L^-1,而野葛茎段愈伤组织的最佳出芽培养基为MS+ NAA 0.5 mg·L^-1+KT 2 mg·L^-1;光照培养更有利于野葛叶片和茎段愈伤组织芽的再分化;野葛叶片愈伤组织再生芽生根的最佳培养基为MS+NAA 0.5 mg·L^-1+PP₃₃₃ 0.5 mg·L^-1,而野葛茎段愈伤组织再生芽生根的最佳培养基为MS+NAA 0.5 mg·L^-1+PP₃₃₃ 3.0 mg·L^-1;野葛叶片和茎段愈伤组织再生芽生根的最佳蔗糖浓度均为30 g·L^-1;叶片再生苗移栽的最佳PP₃₃₃浓度为1.0 mg·L^-1,茎段再生苗移栽的最佳PP₃₃₃浓度为3.0 mg·L^-1;叶片和茎段再生苗的最佳移栽基质均为蛭石:珍珠岩（2:1）。     

培养基成分对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响

以Bs＋0．5mg／L NAA＋0．5mg／L BA为基本培养基,研究了B5培养基中8种主要无机盐浓度对杜仲愈伤组织生长及绿原酸和总黄酮两种次生代谢产物含量的影响。结果表明：在1000～5000mg／L范围内增加培养基中KNO3的含量有利于愈伤组织生长,B5培养基中当KNO3的浓度达到2／3时,绿原酸和总黄酮含量及产量最高;(NH4)2SO4以4／3原浓度时对愈伤组织生长量、总黄酮含量及产量最高,对绿原酸的含量则是其为原浓度的1／3时最高;MgSO4以2／3浓度对生长量及1／3浓度对绿原酸、总黄酮积累最高;NaH2PO4、CaCl2和MnSO4以原浓度的愈伤组织生长和次生代谢产物合成最好;ZnSO4和FeSO4的原浓度愈伤组织的生长量最大,而1／3浓度的绿原酸和总黄酮含量最高。     

一株产虾青素的黄杆菌CF-60的研究

从土壤中分离到一株黄杆菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ）Ｃ_Ｆ－６０,该菌的生长需Ｍｇ^２＋存在,ＭｇＳＯ_４·７Ｈ_２Ｏ的最适浓度为０．２％;蛋白胨是该菌株生长的最好氮源,它不能利用无机氮。种龄超过９６ｈ的菌体不能在新鲜培养基中生长。经５４ｈ的２Ｌ恒化器发酵,生物量达６．８ｇ／Ｌ,色素产量为１０．６ｍｇ／Ｌ。该菌产生的类胡萝卜素成分简单,主要成分的含量为９０．３％,该成分经初步鉴定是分子结构中含有羰基和羟     

锁阳愈伤组织诱导和增殖及不定根分化

以药用寄生植物锁阳的不同部位肉质茎为外植体,研究外植体形态及植物生长调节剂配比对愈伤组织形成、增殖及不定根分化的影响,建立了高效的锁阳肉质茎愈伤组织诱导、增殖和不定根分化体系。结果表明,锁阳茎下部大小为1．5cmx1．5cmxl．5cm的外植体,维管束平行于培养基放置,有利于愈伤组织形成;外植体培养50d,愈伤组织形成。高效的愈伤组织诱导培养基为Ms＋6-BA1．0mg.L-1＋2,4-D3．0mg·L-1,愈伤组织诱导率可达67％;增殖培养基为Ms＋6．BA0．5mg·L-1。＋2,4-D1．5mg·L-1,NxsN74％;在Ms＋6．BA1．0mg·L-1＋NAA2．0mg·L-1。分化培养基中,不定根诱导率达56％。     

正交设计法优化三岛柴胡愈伤组织培养基

目的:优化三岛柴胡愈伤组织培养条件。方法:采用正交设计法,以相对生长速率、鲜重和干重为考察指标,对三岛柴胡愈伤组织生长的MS培养基成分进行单因素多水平和多因素多水平考察。结果:最佳培养基为:MS+3%蔗糖+10/40mmol.L-1NH4+/NO3-+3.75mmol.L-1HPO24-+NAA(0.005mg.ml-1)+6-BA(0.010mg.ml-1)。最佳培养条件下,愈伤组织相对生长速率为0.1548,干重达0.1668g.瓶-1。结论:2,4-D与NAA配合使用可以促进三岛柴胡愈伤组织快速生长,L9(34)正交设计实验中愈伤组织干重明显高于单因子实验设计的。     

低温诱导唐古特红景天细胞分泌抗冻蛋白

选择青海高原海拔4000m高山上生长的唐古特红景天为实验材料,以叶片为外植体,在MS+BA₂+NAA_0.2固体培养基上诱导出黄绿色、松脆愈伤组织.愈伤组织细胞在同样成分的液体培养基中培养获得成功.在悬浮培养液中可检测到分泌蛋白的存在.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,低温锻炼或脱落酸（ABA）诱导后,细胞分泌蛋白的多肽谱带数增加.与此相对应的是,细胞的抗冻能力也明显提高.PAS染色揭示多肽中均含有糖基.通过测定热滞值,确信细胞分泌蛋白是具有抗冻活性的糖蛋白.     

外植体与不同理化因子对虎杖愈伤组织诱导及次生代谢产物形成的影响

考察了外植体、培养基及光照条件对中药植物虎杖愈伤组织形成及次生代谢产物生产的影响。总的来看,所有愈伤组织中总酚和总黄酮含量比原植物的含量高2—3倍;而蒽醌的含量比原植物中含量低。外植体对愈伤组织形成及次生代谢产物生产的影响很大,所考察的3种外植体中。叶外植的愈伤组织诱导率最高而源于根外植体的愈伤组织具有最好的次生代谢能力。所考察的6种培养基中,MS＋0．5mg／L 2,4-D＋1．0mg／L 6-BA和N6＋0．5mg／L 2,4-D＋1．0mg／L 6-BA无论对于愈伤组织的产生还是次生代谢产物的累积都有较优表现。光照对愈伤组织诱导及次生代谢产物产生有明显影响。但二者无规律性联系。     

草木樨状黄芪甲硫氨酸抗性系的原生质体培养及植株再生

建立了草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides Pall．)甲硫氨酸抗性系原生质体再生植株的实验体系。以茎切段诱导的松软愈伤组织为材料,通过酶法分离出大量有活力的原生质体。原生质体经培养持续分裂形成了愈伤组织,并高频率地分化出再生苗。比较了不同培养基、培养方法和培养密度对原生质体分裂和再生的影响。结果表明,原生质体以3×10⁵/mL的植板密度,采用琼脂糖岛法培养在附加1．0mg／L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0．5mg／L 6-苄氨基嘌呤(6BA)、500mg／L水解酪蛋白、3％蔗糖、0．3mol／L甘露醇的KM_8p培养基中,可获得最佳效果,其细胞分裂频率达38％左右。原生质体培养后仍然保持对甲硫氨酸的抗性,同时对乙硫氨酸表现交叉抗性。